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(2）液液分配色谱法
基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性化合物的分离。 （3）离子交换色谱法
基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。薄壳型离子交换树脂柱效高，主要用来分离简单的混合物；多孔性树脂进样容量大，主要用来分离复杂混合物。 （4）凝胶渗透色谱法
又称为尺寸排阻色谱法 。1959年首先用于生物化学领域。以溶剂为流动相，多孔填料（如多孔硅胶、多孔玻璃）或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。当混合物溶液入凝胶色谱柱后，流经多孔凝胶时，体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过，较早地被冲洗出柱外，而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去，较晚地被冲洗出来，混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。用凝胶渗透色谱的优点是：分离不需要梯度冲洗装置 ；同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量；试样在柱中稀释少，因而容易检测；组分的保留时间可提供分子尺寸信息；色谱柱寿命长。它的缺点是：不能分离分子尺寸相同的混合物，色谱柱的分离度低；峰容量小；可能有其他保留机理起作用时引起干扰。凝胶渗透色谱法为测定高聚物分子量和分子量分布提供了一个有效的方法，此外还可用来分离齐聚物、单体和聚合物添加剂等。 （5）离子色谱法
采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法，样品展开方式采用洗脱法。根据不同的分离方式，离子色谱可以分为高效离子色谱 、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换。离子排斥色谱法用高容量的树脂，分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。
离子色谱仪由淋洗液贮存器 、泵 、进样阀 、分离柱 、抑制柱、电导检导器和数据处理单元等组成。离子色谱仪最重要的部件是分离柱，装有离子交换树脂。抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件，其作用是将淋洗液转变成低电导部分，以降低来自淋洗液
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的背景电导，同时将样品离子转变成其相应的酸或碱，以增加其电导。分离阴离子，抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂；分离阳离子，抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂。检测器分通用型检测器与专用型检测器。前者如电导检测器，对检测池中所有离子都有响应；后者如紫外-可见分光光度计，对离子具有选择性响应。
1.3 紫穗槐果实化学成分和Amorfrutin的研究现状
紫穗槐原产于美国、加拿大和墨西哥。这种新的抗糖尿病物质因此被命名为Amorfrutin。研究人员利用糖尿病小鼠证实Amorfrutin不仅具有降低血糖的特性，还具有抗炎效应。此外，它们还可以预防脂肪肝-一种因过量高脂营养引起的常见病[40]。科学家们发现紫穗槐果实等物质里所含有的天然活性物质具有简单的化学结构。
研究证实，经过硅胶柱层析、薄层制备色谱、高效制备色谱等分离手段，从紫穗槐果实的石油醚和醋酸乙酯提取物中分离得到15个单体化合物。利用理化性质和波谱学方法，鉴定了其中的12个化合物的化学结构，包括1个芪类化合物，9个黄酮类化合物，1个三萜类化合物和1个高级脂肪醇。分别为3,5-二羟基-4-牻牛儿基联苄(1)、5,7-二羟基-8-牻牛儿基双氢黄酮(2)、6a,12a-去氢鱼藤素(3)、6a,12a-去氢-α-毒灰叶酚(4)、灰叶素(5)、去氢色蒙酮(6)、7,4-二甲氧基异黄酮(7)、5-羟基-7,4-二甲氧基异黄酮(8)、7，2，4，5-四甲氧基异黄酮(9)、2-羟基-4，4-二甲氧基查耳酮(10)、β-谷甾醇(11)、正三十碳醇(12)。其中化合物6为一个新的天然产物，化合物1为首次从豆科植物中分离得到的已知化合物，化合物8、10、11、12为首次从紫穗槐属中分离得到的已知化合物，化合物2、3、4、5、7、9为首次从中国产的紫穗槐果实中分离得到的已知化合物。研究人员利用糖尿病小鼠证实Amorfrutins不仅具有降低血糖的特性，还具有抗炎效应。此外，它们还可以预防脂肪肝-一种因过量高脂营养引起的常见病[41]。
沈阳化工研究院焦娇等研究员从植物形态、果实性状、显微特征、化学成分等方面对紫穗槐果实进行了生药学研究。通过硅胶柱层析、薄层制备色谱、高效制备色谱等分离手段，从紫穗槐果实的石油醚和醋酸乙酯提取物中分离得到15个单体化合物。利用理化性质和波谱学方法，鉴定了其中的12个化合物的化学结构，包括1个芪类化合物，9个黄酮类化合物，1个三萜类化合物和1个高级脂肪醇。分别为3,5-二羟基-4-牻牛儿基联苄(1)、5,7-二羟基-8-牻牛儿基双氢黄酮(2)、6a;12a-去氢鱼藤素(3)、6a,12a-去氢-α-毒灰叶酚(4)、灰叶素(5)、去氢色蒙酮(6)、7,4-二甲氧基异黄酮(7)、5-羟基-7,4-二甲氧基异黄酮(8)，2,4,5-四甲氧基异黄酮(9)、2-羟基-4，4-二甲氧基查耳酮(10)、β-谷甾醇(11)、正三十碳醇(12)。其中化合物6为一个新的天然产物，化合物1为首次从豆科植物中分
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离得到的已知化合物，化合物8、10、11、12为首次从紫穗槐属中分离得到的已知化合物，化合物2、3、4、5、7、9为首次从中国产的紫穗槐果实中分离得到的已知化合物[10]。
1.4 实验目的和意义
对于原产于美国的甘草和紫穗槐果实中含有的Amorfrutin的抗性研究对医学有巨大的意义，如果证实了紫穗槐的果实中确实含有Amorfrutin且能通过实验找到最优的提取分离方法，那将具有不可估量的价值。
本实验主要目的就是分离鉴定紫穗槐果实里是否含有Amorfrutin，然后优化鉴定和提取工艺。由于Amorfrutin有着抗癌、抗菌等药物活性，所以对Amorfrutin的提取对研研究发明新的药物便有了实际的意义。因此，就需要我们通过实验找到可行的提取方法，完善提取工艺，以便从国内栽培的紫穗槐果实里得到更多更纯的Amorfrutin，继而得到高产率的Amorfrutin，最终希望能将研究结果投入生产，获得大量高效的Amorfrutin抗性药物，
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第2章 紫穗槐果实里Amorfrutin的提取
2.1 实验仪器装置和试剂
2.1.1 实验仪器
实验所用仪器见表2-1，
表2-1主要仪器一览表 序 号 1 2 3 4 5 6 名 称 恒温磁力搅拌器 循环水式多用真空泵 旋转蒸发器 恒温水浴锅 帕斯帝卡超纯水机 液相色谱质质谱联用仪 型号 85-2B SHZ-D(Ⅲ) RE52CS W-O PSDK-30-D LCMS-2010EV 备 注 金坛市医疗仪器厂 郑州博科仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 巩义市予华仪器有限责任公司 北京子涵世纪科技有限公司 SHIMADZU/岛津仪器有限公司 2.1.2 实验装置 图2-1 提取紫穗槐果实里的Amorfrutin装置图 12
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2.2 实验试剂
表2-2 主要试剂一览表
序 号 1 2 3 4 5 6 名 称 紫穗槐种子 乙二醇二甲醚 乙酸乙酯 石油醚(60~90℃) 碳酸氢钠 无水硫酸钠 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 级别 生产厂家 太平洋紫穗槐培育中心 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 2.3 实验原理 本实验采用溶剂萃取法对紫穗槐果实里的Amorfrutin进行提取。采取的溶剂是无水乙醇，由于乙醇的挥发性比较大，因此采用水浴加热回流。根据溶剂的互不相溶的性质，对分层后的含Amorfrutin的组分进行后处理，用液相质谱联用法对提取液里的成分进行鉴定。
为优化提取工艺，此实验分为三个方案进行对比实验。分别为用没有粉碎过的紫穗槐种子，和粉碎过的紫穗槐种子来进行提取实验。以及采用不同的萃取溶剂，分别对其提取后的产物的大致的量的比较，以得出紫穗槐果实里Amorfrutin提取的最佳工艺。
2.4 实验步骤
方案一：称取500g紫穗槐种子（种子为颗粒未经粉碎），与1000ml乙醇混合于三口烧瓶里，按如图2-1的装置图，在搅拌的条件下水浴83摄氏度加热并搅拌48小时（过程中需定时的向水浴锅中填充水，防止水浴锅因干涸而影响提取温度）。
冷却到室温后，用真空旋转蒸发仪进行抽滤，得到乙醇提取物。然后真空旋转蒸发浓缩，得到深红色粘稠液体（在旋蒸的过程中要注意防止爆沸，加入的提取液不能超过圆底烧瓶的一半），静置与烧瓶中，用封口胶封好以防止溶液挥发。并将乙醇回收利用。对得到的深红色粘稠液体再进行液相——质谱连用分析，观察进样前和进样后的质荷比和相对丰度的变化，并做好记录以备分析。流程图如图2-3：
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