121.3℃,15~30min；含糖类的培养基常在0.56Kg/cm2,112.6℃,15~30min;对于含糖类要求较高的培养基，可先将糖进行滤菌或间接除菌，再与其他已灭菌成分混合）（PS2：大多数实验室中称一个样品无菌，就是指在样品中找到活菌体的可能性不大于百万分之一）
十、消毒与灭菌-微生物生长繁殖的控制
消毒（disinfection），较大程度上减少物体表面或材料内部病原微生物的数量，使其无法引起疾病。灭菌（sterilization）杀死或除去材料中或物品上所有的微生物。 微生物生长控制三规律：（1）微生物死亡呈对数速度，即在一定时间间隔内微生物以一定比例死亡；（2）微生物数量越少，灭菌所需的时间越短（尽可能做好灭菌前的预处理）；（3）不同微生物对不同抗微生物剂敏感度不同。 根据消毒灭菌原理不同可分为两大类： （1）化学物质控制法：
1、抗微生物剂（antimicrobial agent），一类能够杀死或抑制微生物的化学物质，可以使天然产物也可是人工合成产物。一方面，根据抗微生物的特性可分为3类：1、抑菌剂：能抑制，但不能杀死细菌；2、杀菌剂：能杀死微生物，但不能使细胞溶解；3、溶菌剂：通过诱导细胞裂解来杀死微生物；另一方面，根据作用效果和作用范围可分为2类：1、消毒剂：通常用于非生物材料上微生物的杀灭（如仪器设备、墙壁地板、家具，水池等；空气常用甲醛、石碳酸、高锰酸钾等进行熏蒸）；2、防腐剂：具有杀死或抑制微生物生长的能力，但一般对于动物或人体组织无毒害作用（如0.1—1%硝酸银用于防止新生儿眼部因淋病奈琴氏菌感染的致盲）。 2、抗代谢物（antimetabolite），一类能够干扰微生物正常代谢从而使微生物生长受抑制的生长因子机构类似物（如磺胺类药物，是叶酸组成部分对氨基苯甲酸（PAB）的结构类似物，磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸形成，抑制转甲基反应，从而导致微生物代谢絮乱。） 3、抗生素（antibiotic），由某些生物合成的或半合成的一类次级代谢物或衍生物，具有抑制或杀死微生物的能力（主要通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞膜、作用于呼吸链以及干扰氧化磷酸化或抑制蛋白、核酸的合成来抑制或杀死微生物。） （2）物理因素控制法： 1、高温灭菌法：包括高压蒸汽灭菌、煮沸灭菌、间歇灭菌法灭菌、干热灭菌、灼烧等。 （PS：衡量灭菌效果的指标：1、十倍减少时间（decimal reduction time），即在一定的温度条件下杀死某一样品中90%微生物或孢子及芽孢所需的时间；2、热致死时间（thermal death time），即在一定温度下杀死液体中所有微生物所需的时间。） 高压蒸汽灭菌，一般实验室最常用的灭菌方法，常用采用0.1013MPa，121.3℃,灭菌15~30min； 煮沸灭菌，将待消毒的材料置于水中煮沸15min或以上，如果在水中加入1%碳酸钠或2%~5%石碳酸则杀菌效果更好；
间歇灭菌法：即通过流通蒸汽或蒸煮反复灭菌，基本操作：第一次蒸煮后杀死微生物的营养体，冷却过夜后，残留的芽孢会萌发；第二次蒸煮，便可将芽孢萌发后产生的营养体全部杀灭。—这样反复2~3次，可以完全杀死样品中含有的芽孢，也可以保持某些营养物质不被破坏；
干热灭菌：主要针对一些玻璃、金属器皿等耐热物品，但所需时间要比湿热灭菌长（如：170℃需要1h，160℃需要2h，121℃需要16h）
（PS2：巴斯德消毒法：1、瞬时法，71.6℃—至少15s（现在常用超高温瞬时法：140℃—
5s）2、维持法：62.9℃，维持30min，可杀灭大部分微生物。） 2、辐射灭菌法（radiation sterilization）：利用电辐射产生的电磁波来杀死微生物。如微波，通过热效应杀灭细菌；UV、X-ray、γ-ray等通过干扰或直接破坏大生物分子来达到杀灭微生物的效果。 3、过滤法除菌：该方法主要针对空气和不耐热液体培养基等设计的方法，有三种类型：1、（最原始的）在一个容器的两层滤板间填充棉花、玻璃纤维。石棉等；2、膜滤器，由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的带微孔（0.22~0.45μm）的膜；3、核孔滤器，由核辐射处理的薄聚碳酸胶片（厚度10μm）再经过化学蚀刻而成（主要用于科学研究）。 4、高渗作用：微生物生长对环境的渗透压也有一定要求，当外界渗透压高于或低于微生物胞内渗透压时，都会阻碍微生物的正常代谢甚至死亡，所以利用改变外界环境的渗透压也可达到控制微生物的效果（如食品腌制）。 5、干燥作用：水是微生物细胞的重要组成部分（占活细胞90%以上），降低物质的含水量直至干燥就可有效抑制微生物生长，防止腐败霉变等。 6、超声波作用：超声波可产生的空穴效应，可将进入空穴区的微生物细胞裂解破碎。
十一、营养缺陷型菌株分离
营养缺陷型（auxotroph），是一种缺乏合成其生存所必需的营养物质的突变型，只有从环境或培养基中获得这些营养物质或前体物才能生长。 影印平板分离法（replica plating）：
（1）将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型和突变型菌株都能生长的主平板a（完全培养基）上，经过培养后形成单菌落； （2）通过一个消毒的“印章”（直径略小于培养皿底，表面包有丝绒布）将a平板的菌落分别原位转移（或印迹）到平板c（与a平板相同营养成分）和平板d（选择培养基，突变型无法生长）；
（3）经过培养后对照观察平板c和d上形成的单菌落，如果在c上生长而d上不生长，则为所需的分离的突变型；
（4）在c平板上挑取d平板上不能生长的相应位置的单菌落，并进一步在完全培养基上划线纯化。
十二、病原体验证试验
1、科赫定理4原则（：要证明某种微生物是引起某种疾病的致病因子所必须满足的4条原则） （1）在每一个病例中必须找到特异的病原体；
（2）病原体必须能从患病宿主中分离得到，且能纯培养；
（3）将纯培养的病原体接种到健康的易感宿主，能够引起同样的病症； （4）从接种后患病的实验宿主中必须能分离到与原始病原体相同的病原体。 （PS:科赫定理可以验证多数但不是所有的病原，因为有些病原体如梅毒密螺旋体很难培养，直到现在也未能人工培养；又有些除了人以外无其他宿主的微生物，除非有志愿者，否则无法接种易感宿主。）
2、验证方法之科赫定理验证法：（a）从感染动物体内分离疑似病原体微生物，然后进行纯培养；（b）将分离并纯培养后的微生物注射到易感健康的实验宿主体内；（c）如果动物患病（可能死亡），分离其体内的疑似病原微生物，并纯培养；（d）比对两次分离得到的纯培养物，如果相同则证明所提取的微生物为该疾病的病原体。
十三、菌株鉴定
常规鉴定大致的步骤（以细菌为例）：（1）首先要掌握菌株的一些基本特征，如细胞的形态、革兰氏染色结果、以及其他突出的形态学特征；（2）了解其营养类型、需氧性等突出生理生化特征；（3）在前边的基础上查阅分类（鉴定）手册或有关资料，确定该菌株属于哪一大类，然后利用资料中有关该类群的分类检索表或特征比较表格等资料中所提供的鉴别特征进行进一步的特征测定；（4）在根据测定结果查对检索表或有关特征描述，逐步缩小菌株的归属范围，初步确定菌株所归属的科、属；（5）如果要鉴定到种，则需要进一步查阅相关属的分种检索表或相关分种的鉴别特征资料。进一步地鉴定，最后初步确定其归属的种。 鉴定方案2：（1）对鉴定样品进行检查，看是否需要进一步纯化；（2）测定该菌株的一些最基本的形态和生理生化特征，然后根据微生物分类鉴定手册等有关资料，确定该菌株属于哪一大类；（3）根据待测菌株所属的类群，进行16rRNA或18SrRNA基因序列测定，从而可以得知该菌株与相关数据库中已知微生物的相似性，进而初步确定其分类地位；（4）进一步检测该菌株的表型特征、生理生化特征以及相关化学组分，必要时进行管家基因序列等分析；（5）综合前边的检测结果，确定菌株的分类地位。
十四、微生物的保藏技术
1、传代培养保藏（短期）
采用传代培养保藏微生物应注意针对不同菌种选择适宜的培养基，并在规定时间内进行转移；在琼脂斜面上保藏微生物因菌种的不同，保藏的时间也会不同，一般来说通过降低被保藏微生物的代谢水平或防止培养基干燥可以延长传代保藏保存的时间。（如：在菌株生长良好时，改用橡皮塞密封或在培养基上覆盖上一层石蜡，并且降低保藏温度；）（PS：悬液保藏法：将一些菌苔直接刮入蒸馏水或缓冲液中，密封置于4℃保藏。）
常用方法：琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养基。
缺点：长期传代操作繁琐、容易放生污染，菌株容易放生突变而产生衰退。 2、冷冻保藏
微生物处于冷冻状态时，其代谢作用也会停止，可达到保藏的目的。注意事项1：进行冷冻时，应适当采用速冻的方法，可避免产生大冰晶从而损伤细胞；同时，升温时也应采用快速升温的方式，可避免因升温而使冰晶增长产生对细胞的伤害；注意事项2：冷冻时的介质也会对细胞产生损伤，因此，像冷冻前加入甘油或二甲亚枫可降低细胞强烈的脱水作用来保护细胞，所以一般冷冻保藏时都需要加入保护剂来提高保藏物的存活率。注意事项3：一般推荐（加了甘油保护剂）在-70℃低温冰箱保存，如条件不足，在-20~-30℃普通冰箱保存是应注意避免因冰箱温度变化引起的培养物的反复冻融而造成的细胞损伤。 3、干燥保藏法（最普遍、有效） 常见的干燥保藏技术：沙土管保存和冷冻真空保藏。
沙土管保存，主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等；一般过程：（1）将菌种接种到斜面，培养至长出大量孢子；（2）洗下孢子制成孢子悬液；（3）然后加入无菌的沙土管中，减压干燥直至将水分抽干；（4）最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置于冰箱。
冷冻真空保藏，是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结后，在真空状态下通过冰的升华作用去除水分；干燥后的样品可以在真空或惰性气体的密闭环境中低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧、低温的状态下进入休眠，进而可长时间地进行保藏。
十五、培养基（culture medium）
1、配制原则：
①选择适合的营养物质：一般而言，培养基都应含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水和能源。但由于微生物营养类型复杂，对营养物质要求也不一样，因此配制培养基时，应首先针对所培养的微生物的营养类型来配制针对性强的培养基。一般常用的3种培养基：（1）牛肉膏蛋白胨培养基，常用于培养细菌；（2）高氏一号培养基，用于培养放线菌；（3）查氏培养基，用于培养霉菌；（PS：酵母菌常用麦芽汁培养基）； ②适宜的营养浓度及配比：培养基中营养物质浓度合适时微生物才能良好生长，浓度过低不能满足微生物正常代谢生长，过高则会抑制生长。另外培养基中各营养物质的之间浓度配比也会影响微生物的生长代谢，其中尤其是碳氮比。
③PH控制：一般而言，细菌和放线菌适于PH7~7.5范围内生长；酵母菌和霉菌适合在PH4.5~6范围内生长；然而由于微生物在生长繁殖过程中的新陈代谢会使的培养基的PH产生变化，所以通常会在培养基中加入磷酸氢二钾或磷酸二氢钾混合而成的缓冲剂，以控制PH。
④控制氧化还原电位：不同微生物生长对氧化还原电位的要求不一样，一般好氧菌Φ值在0.1V以上能正常生长（0.3~0.4V为宜），厌氧菌只能在低于0.1V条件下生长，兼性厌氧菌在Φ值为0.1V可进行有氧呼吸，0.1V以下进行发酵；控制方法：在PH值稳定情况下，提高氧分或加入氧化剂可增加Φ值；在培养基中加入抗坏血酸、半胱氨酸等还原性物质可降低Φ值。
⑤原料选择：尽可能利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中。 ⑥灭菌处理：要获得纯培养物，就必须避免杂菌污染，因此需要对使用器材、工作场所和配制好的培养基进行消毒灭菌。培养基常用高温高压灭菌处理，工作场所常定期使用福尔马林进行熏蒸。
2、几种培养基：（1）基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需要的基本营养物质的培养基；可满足大部分微生物的最基本生长需求（如：牛肉膏蛋白胨培养基）；
（2）加富培养基，也称营养培养基即在基础培养基中加入某些特殊的营养物质制成的类营养丰富的培养基（特殊营养物质：如血液、血清、酵母浸粉、动物组织液等），常用于培养营养要求严苛的异养微生物（如百日咳德氏菌）；（PS：加富培养基与选择培养基区别：加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势从而得到分离；而选择培养基一般是抑制不需要的微生物的生长，从而使所需要的微生物增殖。）
（3）鉴别培养基，用于鉴别不同类型微生物的培养基。原理：通过加入某种特殊的化学物质，从而使目标微生物在培养基生长后能产生某种代谢物，而这种代谢物可以与培养基中的特殊化学物质发生特殊的化学反应，产生明显的特征性变化，进而就可将该微生物与其他微生物区分开来。（PS：主要用于快速分类鉴定以及分离和筛选菌种）
（4）选择培养基，用来将特定的微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基；其原理是在培养基中加入特定的化学物质或特殊营养物质，抑制不需要的微生物生长，来增加所需微生物的生长繁殖。
（5）其他几种培养基：a.分析培养基，常用来分析某些化学物质的浓度也可用于分析微生物的营养需求；b.还原性培养基，专门用来培养厌氧型微生物；c.组织培养物培养基，含有动植物细胞，用来培养病毒、衣原体、立克次氏体等专性活细胞寄生的微生物。 3、培养技术的突破与发展： 进展一、在培养基中加入一些非传统的生长底物促进新型微生物的生长，并发现一些新生理型的微生物。（如从海底沉积物中分离出一种以有毒亚磷酸作为电子供体，硫酸作为受体的新型化学能无机自养微生物—Desulfotignum）；
进展二、采用营养成分缺乏的培养基—营养浓度是正常的1%（如以补充磷酸盐、铵盐和有
机碳源的海水为培养基，研究发现了北美西海岸的浮游细菌（SAR11）的生态分布和确定其进化的分类地位）；
进展三、采用新颖的培养方法，模拟天然环境，以流动式供应营养液，使不同微生物细胞间可以进行细胞交流，实现细胞互喂（cross-feeding），促进菌落形成。方法有：细胞微囊法和扩散小室法。
十六、显微镜与显微技术
根据显微镜的成像原理可将当前所使用的显微镜分为3类：光学显微镜、电子显微镜和探针扫面显微镜。 （1）光学显微镜。
1、明视野显微镜，原理：光纤投射照明，物象处于亮背景中。
2、暗视野显微镜，通过特殊的聚光器实现斜射照明，亮物象形成于暗背景中。（应用：不易被染色或染色易破坏样本结构的观察-如梅毒密螺旋体；观察活细胞运动）
3、相差显微镜，通过特殊的聚光器和物镜将通过样品不同部位产生的光波相位差转变为振幅差（明暗差异），以提高样品不同部位间的反差。（应用于活细胞及其内部结构的观察） 4、荧光显微镜，经过荧光染料染色或荧光抗体处理的样品在紫外线等短波长光照射下激发出长波光的可见光，在暗背景中形成明亮的彩色物象。
5、激光共聚焦显微镜，以激光作为光源，每次照明样品的一个点，连续扫描后经计算机处理获得样品二维或三维图像，对工作环境和技术操作要求较高。（应用：对完整细胞的细微立体结构进行观察和分析） （2）电子显微镜。
1、透射电镜，用电子束作为“光源”聚焦成像，分辨率较光学显微镜大大提高，但设备庞大、造价高昂，样品观察需要真空环境。（用于观察病毒等颗粒微小的样品的形态特征或通过超薄切片观察细胞内部结构）
2、扫描电镜，电子束在样品表面进行扫描，收集样品表面被激发形成的二次电子形成的物象。（一般用于观察样品表面的立体结构） （3）探针扫描显微镜。（此类显微镜相比电子显微镜，能提供更高分辨率，且可在生理状态下对生物大分子或细胞结构进行观察，对观察环境要求相对较低，且仪器体积小，价格也相对便宜）
1、隧道扫描显微镜，用细小的探针在样品表面进行扫描，通过记录针尖和样品间隧道效应电流的变化形成物象。
2、原子力显微镜，利用细小探针对样品表面进行恒定高度扫描，同时通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获得样品表面形貌信息。
十八、同步培养技术(synchronous culture)
同步培养，是一种使微生物群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞的培养方法；同步生长，以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式。
同步培养主要可归纳为两大类：机械法和环境条件控制技术。 1、机械法：常用的有三种：（1）离心法（质量），将不同步的细胞悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液中，通过密度梯度离心将不同细胞分布呈不同细胞带，每一细胞带大致都是出于同一生长阶段，分别将其取出进行培养便可获得同步细胞；