（2）过滤分离法（大小）：将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同的微孔过滤器，从而将大小不同的细胞分开，然后分别将滤液中的细胞取出进行培养，就可获得同步细胞； （3）硝酸纤维素滤膜法（粘附性），其原理是根据细菌能紧紧地结合到硝酸纤维素滤膜上的特点，将细菌悬液通过垫有硝酸纤维素滤膜的过滤器，然后将滤膜颠倒过来，在让培养基流过滤器，以洗去未结合的细菌，这时新分裂的细菌被洗下来，分步收集并通过培养即可获得同步细胞。 2、环境条件控制法：这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类同步细胞的方法。主要有：（1）温度控制法：通过适宜与不适宜的温度来回交替处理后，通过培养便可获得同步细胞；（2）培养基成分控制法：培养基中的碳、氮源或生长因子不足时，可导致细菌缓慢生长直至停止。因此，方法一（饥饿法）：将不同步的细菌在营养不足条件下培养一段时间，然后再转移到营养丰富的培养基中培养；方法二（抑制法）：将不同步细胞转接到含有一定浓度的，能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质（如抗生素等）的培养基中培养一段时间，再转接到完全培养基里培养。
十九、微生物生长测定技术
微生物生长测定，可以用来客观评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产的作用效果，或客观反映微生物的生长规律。 测定方法有：计数法、重量法和生理指标法等。 1、计数法，此类方法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。其中又可分为：（1）直接计数法，利用特定的血球计数板或细菌计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中的微生物数量；缺点：不能区分活、死细胞；计算公式：每毫升原液细菌数=每小格平均细菌数*400*1000*稀释倍数。
（2）间接计数法，又称活菌计数法，原理：每个活细菌在适宜的培养条件下可以通过生长形成单一的菌落；常用方法：将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择3个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌培养皿中，在倒入适量的已熔化并降温至45℃左右的培养基，混匀、冷却凝固后放入是以环境中培养，长出菌落后计数；公式：每毫升原液活菌数=同一稀释度3个以上重复培养皿菌落平均数*稀释倍数*5；缺点：易于因人为失误而造成污染或结果不稳定和测定丝状体微生物。
（3）比浊法，原理：在一定范围内，细菌的悬液中细胞浓度和浑浊度呈正比，即细菌数量越多，光密度越大。方法：借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度（optical density-OD）表示菌量。 2、重量法，是根据每个细胞都有一定的重量而设计的，用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。方法（鲜干重）：将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经过洗涤，再离心后直接称重，求出湿重（如果是丝状微生物，过滤后用滤纸吸干是水分再称重）；然后将样品装入已知重量的培养皿等容器中，在105℃下烘干至恒重，后在干燥器中冷却，称量干重。（PS：如果测定长在培养基上的丝状真菌、放线菌，可将培养基缓慢加热到50℃熔化琼脂，再过滤得到菌丝体，然后用生理盐水洗涤）； （PS2：凯氏定氮法—总含氮量与蛋白质总量间的关系换算公式：蛋白质总量=含氮量*6.25；细胞总量=蛋白质总量/65% 约等于总蛋白质量*1.54） 3、生理指标法，生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等，样品中生物数量越多或生长越旺盛，这些指标越明显，因此借助特定仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等来测定。（主要用来分析微生物的生理活动）
二十、病毒研究的基本方法
主要有：病毒的分离与纯化、病毒定量测定、病毒的鉴定三大类。 1、病毒的分离与纯化：
（1）分离
病毒的分离是将疑有病毒而待分离的标本经过处理后，接种于敏感宿主、鸡胚或细胞中培养，经过一段时间孵育后，通过检查病毒特异性感染表现或用其他方法来肯定病毒存在的研究方法。主要过程：（a）标本采集与处理：原则，应确保用于分离的样本应含有足够量的活病毒；所以采集策略：根据所需采集标本的种类，确定采集时间和标本处理方法；此外，一方面为了避免细菌污染，标本一般都应该加入抗生素除菌（或用过滤、离心），另一方面，为了使病毒充分释放且保持活性，在研磨或超声波处理后应该立即接种（若需保存或运送，数小时内可置于50%中性甘油内4℃保存，较长时间则需-20℃或干冰保存）；
（b）标本接种与感染表现：接种策略，标本接种于何种实验宿主（鸡胚、细菌、动物细胞等），以及选择何种接种途径主要取决于病毒宿主的范围和组织嗜性，同时应该考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判断等要求。（例如：噬菌体—细菌培养物，液体培养基-浑浊变清澈，琼脂平板-噬菌斑；嗜神经病毒—脑内接种；嗜呼吸道病毒—鼻腔接种、鸡胚尿囊等）（PS：由于组织培养生长的细胞对病毒敏感性较体内成熟细胞高，同时体外也没有免疫系统干扰，操作相对简便，所以目前多数动物病毒都利用离体细胞来培养）。感染表现：显微镜观察现象—大多数动物病毒感染敏感细胞培养物都能引起细胞产生病变效应（cytopathic effect，CPE），如细胞聚集成团、肿大、圆缩或形成合胞体、出现包涵体，乃至细胞裂解等现象；所以接种于细胞培养的标本主要以细胞病变作为病毒感染指标。肉眼观察现象—标本进过适当稀释在进行接种并辅以染色处理，病毒便可在单层细胞上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（Plaque）。 （2）病毒纯化
制备纯净的病毒材料而尽可能除去其他杂质的过程。 1、两大纯化标准：（a）纯化的病毒制备物必须保持病毒原有的感染性；（b）纯化病毒制备物的毒力大小、形态、密度、化学组成及抗原特性应当具有均一性表现，并可利用超速离心、电泳、电镜或免疫学技术进行检查。
2、常用纯化方法：第一，利用蛋白质提纯的方法来纯化病毒（病毒的主要成分是蛋白质）故可以使用盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析及离子交换层析等；第二，超速离心纯化，因为病毒颗粒有一定的大小、形状和密度，，一般可以在10000~100000g的离心场中沉淀1~2小时。（广泛用于病毒纯化） 2、病毒感染性测定（assay of infectivity）
病毒的感染性测定，是指对有感染性病毒颗粒数量的测定；感染性测定所测得的都不是感染性病毒颗粒的绝对数量，而是能引起宿主或细胞一定特异性反应的病毒最小剂量，即感染单位（IU）；病毒的效价（滴度）：每毫升病毒悬液所含的感染单位数目（IU/ml）。 测定方法：
（a）蚀斑测定法（最先是为测定噬菌体感染性所建立的）：
原理：病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
1、 噬菌体检测：一般采用琼脂叠层法，即以一定量的经过系列稀释的噬菌体悬液分别于高
浓度的敏感细菌悬液以及半固体营养琼脂均匀混合后，涂布在已铺有较高浓度的营养琼脂平板上，经过孵育后在延伸成片的菌苔上可出现分散的单个噬菌斑。因为噬菌斑的数目与加入样品的有感染性的噬菌体颗粒数量呈正比，统计噬菌斑数目后可计算出噬菌体
悬液的效价，并以菌落形成单位（PFU）/mL表示；
2、 动物病毒检测：其噬菌斑的测定方法与噬菌体的噬菌斑计数方法类似，不同在于动物病
毒是以生长在固定支持物上的单层细胞代替了菌苔，由于动物病毒在单层细胞上所产生的蚀斑表现不同，所以有空斑测定、合胞体计数、转化灶测定和吸附蚀斑测定等不同方式，但最终的病毒效价都以蚀斑形成单位PFU表示。 3、 植物病毒：坏死斑测定（枯斑测定），用金刚砂之类的能破坏植物表皮与细胞壁的粉末
状物质与一定量的植物病毒混合摩擦植物叶片进行接种，以产生的坏死斑的数目来测定病毒效价。
（PS：病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位（PFU/ml）来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105（PFU/ml））
（PS2：技术应用：蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆（无性繁殖纯系）、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。）
（b）终点法（针对不能形成蚀斑或或坏死斑的动植物病毒） 操作方法：1、取等体积的进过10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元；2、经过一致时间孵育后，试验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应所对应的病毒剂量确定为病毒样品的效价（半数效应剂量），以对应的病毒稀释度的倒数的对数值表示。半数效应剂量类型：（1）半数致死剂量—LD50；（2）半数感染剂量—ID50；（3）半数组织培养感染剂量—TCID50。 3、病毒的鉴定
（1）根据病毒感染宿主范围及感染表现鉴定，大多数病毒都有相当专一的宿主范围，因而病毒的宿主谱可作为病毒初步鉴定的指标；
（2）病毒的理化性质鉴定，利用电镜技术、超速离心技术等可检查毒粒大小、形态和结构特征，测定病毒及其组分的沉降系数、浮力密度和相对分子质量，鉴定病毒的核酸类型；以及紫外线、化学药剂和脂溶剂等理化因子对病毒感染性作用，确定病毒的对不同理化因子的敏感性。
（3）血细胞凝集性质鉴定，许多病毒能吸附于一定种类的哺乳动物剧或禽类的血细胞表面产生凝集现象，而且不同的病毒所凝集的血细胞的种类以及发生凝集所要求的温度、PH条件可能不同，这些性质给病毒鉴定提供了重要的依据。
（4）免疫学鉴定，建立在抗原-抗体特异性反应基础上的免疫学方法是一类常见且重要的病毒鉴定方法，主要技术有：免疫沉淀反应、凝集反应、酶联免疫反应、血凝抑制实验、中和实验、免疫荧光、免疫电32镜以及单克隆抗体等。
PS：利用病毒的性质来检测抗原-抗体反应的方法：血凝抑制实验和中和实验。血凝抑制实验，是根据特异性的病毒抗体和病毒表面有凝血活性的蛋白质结合，可抑制病毒血细胞凝集反应发生的原理而设计的；中和实验，是建立在病毒中和作用的基础上，即某些特异性病毒抗体与病毒颗粒作用，能够使病毒失去感染能力从而阻止了病毒的繁殖的原理设计的。 （5）分子生物学方法，可运用聚丙烯酰氨凝胶电泳、蛋白质肽图与N端氨基酸分析、核酸的酶切图谱和寡核苷酸图谱分析、分子杂交、序列测定及PCR等方法鉴定病毒核酸、蛋白质等组分的性质，在分子水平上阐明病毒性质，可对进行准确分类鉴定提供直接可靠的证据。（例如尚不能在细胞培养中增殖的人乳头瘤病毒（HPV）的检测主要是用各种类型的核酸杂交方法，其分型亦是根据基因组的序列同源性，分型界限是50%同源性，超50%同源性则为亚型）
二十一、DNA作为遗传物质的实验
证明DNA作为遗传物质的第一个实验：
Avery和他的合作者分别用降解DNA、RNA或蛋白质的酶作用于有毒的S型肺炎双球菌细胞提取物，选择性地破坏这些细胞成分，然后在于R型细胞混合；观察结果显示，只有DNA被酶降解的提取物无转化作用，从而说明了DNA是格里菲斯实验中的转化因子。 证明DNA是遗传物质的第二个实验： 1953年，Alfred和Martha用32P标记T2噬菌体的DNA和用35S标记噬菌体的蛋白质外壳，然后用这两种不同标记的病毒分别侵染大肠杆菌，后离心分析发现，用含有35S蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大多数放射性同位素都留在宿主细胞外边，而用32P标记的T2噬菌体侵染宿主时，则发现32P DNA被注入了宿主细胞，并产生了噬菌体后代。
二十四、诱变育种技术
诱变育种是指通过各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率后在通过一定的筛选方法获得所需的菌株。
常用的诱变育种方法：
物理诱变—紫外线诱变法：1、诱变处理前，先开紫外线灯预热20min，使光波稳定；2、将3~5ml细胞悬液置于6cm培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上照射3~5min进行表面杀菌；3、打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，照射处理一定时间（根据实际情况）；4、处理后，在红光灯下，吸取一定量的菌液，经过稀释后，去0.2ml涂平板（或经暗培养一段时间后涂板）。
化学诱变—5-溴尿嘧啶（5-BU）诱变法：1、称取5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml；2、将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其耗尽自身营养物质；3、将5-UB加入培养基中，浓度10~20ug/ml，混匀后倒平板，涂菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑取菌落测定。
（PS：1、为了提高诱变效率，常用物理、化学两种诱变剂交替使用；2、一般选用菌株的对数期效果最好）
二十五、诱导原生质体融合技术
原生质体融合技术是将遗传性状不同的两种菌融合为一个新细胞的技术。主要步骤包括：原生质体准备、原生质体融合、原生质体再生和融合子选择。
原生质体准备：酶处理，完全消化或部分消化细胞壁，释放原生质体；
原生质体融合和再生：可通过化学因子诱导或电场诱导进行融合，其中化学诱导常用PEG作为诱导剂，加入PEG后再加入钙离子、镁离子等阳性离子；电融合技术，是将原生质体置于电场中极化偶极子，并沿电力线方向排列成串，然后施加直流脉冲击穿原生质体膜，促进其融合。诱导融合结束后，将原生质体置于再生培养基上（高渗培养基），使其细胞壁得以再生。
融合子筛选：主要依靠在选择培养基上的遗传标记，有两个遗传标记互补，就可以确定融合子。其中一样缺陷标记是常规而准确的选择方法，另外，还有灭火原生质法—将融合的亲株原生质体灭活后融合可获得具有活性的融合子（可用于没有遗传标记的情况）；以及荧光染色法—在双亲原生质体制备过过程中，向酶解液中加入荧光色素使其形成带有荧光色素的原生质体。
二十六、DNA shuffling技术
DNA shuffling是一种人工分子进化技术，可模拟生物的分子进化历程，并可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百至上万倍的功能性突变基因。 原理：将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些随机小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一个基因拷贝片段的引物时，会引起模板转换，重组因而产生，导入细胞后，再选择正突变体作为新一轮的体外重组。
优点：筛选效率高，2~3次循环即可获得突变体。
缺点：主要适合于某一基因产物量的提高，而无法处理多种性状的改变。
二十八、原位研究方法（微生物生态）
原位研究方法，即在自然或模拟自然条件下观察微生物的结构与功能的研究方法。 主要有：原位观察、微生境模拟技术
原位观察：激光共聚焦显微镜来实现微生物群落的原位观察； 微生境模拟技术：微生境是直接对微生物产生效应的环境，通过控制生境中环境因素可模拟微生境和发生于微生境中理化因子的梯度变化，从而可对微生物的活动进一步了解。此外，原位培养是另一种微生境技术，一般使用瓶子、实验通等组成围隔，将要研究的样品放入原来的位置进行培养。
重组病毒载体
基因工程
基因工程的核心内容：基因重组、克隆和表达。 基本操作过程： （1）基因的获取
外源基因可从基因文库或cDNA文库中分离，或通过化学合成基因，也可以通过PCR体外扩增基因，甚至可以借助定位诱变获取改造后基因。 （2）外源基因与载体体外重组
利用DNA重组技术，将外源基因插入到质粒、病毒或染色体DNA片段构成的载体中，形成具有自主复制起点的“重组DNA分子” （3）重组DNA分子导入宿主细胞
通过转化、转染、感染等方式将重组DNA导入微生物或动植物细胞中，使其复制，由此可获得基因克隆。
（4）目的克隆的筛选与鉴定
通过载体携带的遗传标记等方法筛选出带有外源基因的阳性克隆，并且在获得目的克隆基因后还需要进行鉴定和测序。 （5）控制外源基因的表达
通过控制适当条件，使导入的基因在细胞内得到表达，产生出人们所需要的产物，或使生物体获得新的性状。
Module 2：微生物的生理生化