②Asp的pI=2.77，Glu的pI=3.22，在pH=3.25的环境中，天冬氨酸带负电荷而谷氨酸几乎不带电荷。而阳离子交换剂可以西服阳离子，对带负电荷的天冬氨酸具有排斥作用，其最先被洗脱下来；不带电荷的谷氨酸不吸附也不排斥，然后被吸脱下来，表现为天冬氨酸先出峰，然后谷氨酸再出峰。 21．为什么鸡蛋清可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂？
因为蛋白质可与重金属离子汞、铅等结合成不溶于水的复合物。则鸡蛋清可以代替机体组织与重金属反应，从而减少汞、铅对机体的损害。 22.酪氨酸-精氨酸-蛋氨酸-脯氨酸
23.简要说明蛋白质变性的概念及变性蛋白质的性质变化，并请举例说明蛋白质变性在食品加工中的应用。
蛋白质的变性：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子特定空间构象被破坏，导致其理化性质改变和生物活性的丧失。
变性后蛋白质性质发生改变，出现生物活性丧失，一些侧链基团暴露，某些理化性质改变如溶解度降低、粘度增加，扩散系数下降、结晶能力丧失等，生物化学性质改变，更容易被蛋白酶水解
食品加工中最常用的变性方式是加热变性，如肉类在高温加热下变性，蛋白质消化吸收率提高。 24.蛋白质分离纯化技术中哪些与它的等电点有关？试述这些技术分离提纯蛋白质的原理。
1）等电点沉淀法，蛋白质是两性化合物，在等电点时其溶解度最小。不同蛋白质氨基酸组成不同，等电点不同，调节蛋白质混合溶液的pH值，可使他们分次沉淀出。
2）离子交换纤维素层析，常用的纤维素衍生物有CM-纤维素（羧甲基纤维素，-O-CH2-COOH）和DEAE-纤维素（阴离子交换剂，带有二乙氨基乙基基团）。蛋白质与离子交换纤维素的结合能力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，在某一pH条件下，不同蛋白质氨基酸组成不同，pI不同，所带的静电荷性质、数量不同，与离子交换纤维素的吸附能力不同。通过改变洗脱液的pH和离子强度，可把不同的蛋白质依次洗脱下来。
3）电泳法（聚丙烯酞胺凝胶电泳、等电聚焦）。
25.简述导致蛋白质变性的原因。在实验操作中，可采取哪些手段减少蛋白质分离纯化过程中的变性机会? 蛋白质变性影响因素：一般温度高于60摄氏度持续一段时间蛋白质均会变性，但不同蛋白耐受高温不同。避免高浓度有机溶剂，如丙酮，乙醚，巯基乙醇等。环境中含有蛋白酶会分解蛋白。高浓度变性剂如盐酸胍和尿素会造成蛋白质变性。在一定浓度盐作用下，也会使蛋白内部的疏水集团暴露而改变折叠结构。pH值变化，强酸强碱条件下会破坏蛋白质结构。
因此，克服和避开上述内容可以减少变性。具体措施：控制温度、pH值。避开强酸强碱和等电点。尽量减少和有机溶剂和变性剂的接触。添加蛋白酶抑制剂，可以减少蛋白分解。盐浓度适宜，不能太高。N-马来酰亚胺，去氧胆酸钠等抗氧化物质，可以防止蛋白被氧化变性。
第二章 酶化学
二、是非题
1.对于可逆反应而言，酶既可以改变正反应速度，也可以改变逆反应速度。 2.酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。 3.酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。
4.辅酶、辅基在酶催化作用中，主要是协助酶蛋白识别底物。 5.Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。
6.Km值是酶的一种特征常数，有的酶虽可以有几种底物，但其Km值是固定不变的。 7.当[S]>> Km时，v 趋向于Vmax，此时只有通过增加[E]来增加v。 8.一个酶作用于多种底物时，其最适底物的Km值应该最小。 9.增加不可逆抑制剂的浓度，可以实现酶活性的完全抑制。 10.正协同效应使酶促反应速度增加。
11.竞争性可逆抑制剂与底物竞争性地与酶的活性中心结合。 12.酶反应的最适pH只取决于酶蛋白本身的结构。
13.酶原激活过程实际就是酶活性中心形成或暴露的过程。 14.酶和底物的关系比喻为锁和钥匙的关系是很恰当的。 15.使用诱导契合假说可以解释许多酶的催化机制。
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16．反竞争性抑制作用的特点是Km值变小，Vm也变小。
17.在非竟争性抑制剂存在下，加入足够量的底物，酶促反应能够达到正常的Vm.。 三、单项选择题（在备选答案中只有一个是正确的） 1.关于酶的叙述正确的是 。
A.所有的酶都含有辅基或辅酶 B.能改变化学反应的平衡点加速反应的进行 C.大多数酶的化学本质是蛋白质 D.都具有立体异构专一性（特异性） 2.酶原所以没有活性是因为 。
A.酶蛋白肽链合成不完全 B.活性中心未形成或未暴露 C.缺乏辅酶或辅基 D.是已经变性的蛋白质 3.关于酶活性中心的叙述，不正确的是 。
A.酶与底物接触只限于酶分子上与酶活性密切有关的较小区域 B.当底物分子与酶分子相接触时，可引起酶活性中心的构象改变
C.一般来说，多肽链一级结构上相邻的几个氨基酸的残基相对集中，形成酶的活性中心 D.酶原激活实际上就是完整的活性中心形成的过程
4.下列关于酶蛋白和辅助因子的叙述，不正确的是 。
A.酶蛋白或辅助因子单独存在时均无催化作用 B.辅助因子直接参加反应
C.一种辅助因子只能与一种酶蛋白结合成一种全酶 D.酶蛋白决定结合酶蛋白反应的专一性 5.某酶促反应中底物浓度〔S〕=1/2Km，则v值应等于 Vmax。 A 0.25 B 0.33 C 0.50 D 0.67
6.某酶促反应速度v达到最大反应速度Vmax的80%，则底物浓度为 。 A.Km B.2 Km C.4 Km D.8 Km 7.一个简单的米氏酶促反应，当[S]《Km时, 。
A反应速度最大 B反应速度难以测定 C底物浓度与反应速度成正比 D增加酶浓度，反应速度显著增大 E [S]增加，Km值也随之变大 8.有机磷杀虫剂对胆碱酯酶的抑制作用属于 。
A.可逆性抑制作用 B.竞争性抑制作用 C.非竞争性抑制作用 D.不可逆性抑制作用 9.关于pH对酶活性的影响，不正确的是 。
A影响必需基团解离状态 B pH改变能影响酶的Km值 C酶在一定的pH范围内发挥最高活性 D破坏酶蛋白的一级结构 10.丙二酸对于琥珀酸脱氢酶的影响属于 。
A.反馈抑制 B.底物抑制 C.竞争性抑制 D.非竞争性抑制 11.Km值的概念是 。
A.与酶对底物的亲和力无关 B.达到Vmax所必须的底物浓度 C.同一种酶的各种同工酶的Km值相同 D.达到1/2Vmax的底物浓度 12.米氏常数Km是一个用来度量 。
A酶和底物亲和力大小的常数 B酶促反应速度大小的常数 C酶被底物饱和程度的常数 D酶的稳定性的常数 13.酶的竞争性抑制剂可以使 。
A.Vmax减小，Km增加 B.Vmax增加，Km增加 C.Vmax不变，Km增加 D.Vmax不变，Km减小 14.利用恒态法推导米氏方程时，引入了除 外的三个假设。
，则［S］—［ES］≈［S］ A.在反应的初速度阶段，E+P→ES可以忽略 B.假设［S］>>［E］
C.假设E+S→ES反应处于平衡状态 D.反应处于动态平衡时，即ES的生成速度与分解速度相等 15.酶的不可逆抑制的机制是由于抑制剂 。
A.使酶蛋白变性 B.与酶的催化中心以共价键结合 C.与酶的必需基团结合 D.与活性中心的次级键结合 16.酶原激活的实质是 。
A激活剂与酶结合使酶激活 B酶原分子一级结构发生改变从而形成或暴露出酶的活性中心 C酶蛋白的变构效应 D酶原分子的空间构象发生了变化而一级结构不变 17.将米氏方程改为双倒数方程后 。
A 1/v与1/[S]成正比 B 以1/v对1/[S]作图，其横轴为1/[S] C v与[S]成正比
7
D Km值在纵轴上 E V值在纵轴上
18.某一酶的动力学资料如下图，它的Km为 。 A. 0.25 B. -0.25 C. 4 D.-4 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -4-202468101/[S](1/mmol.L) 19.酶的活化和去活化循环中，酶的磷酸化和去磷酸化位点通常在酶的 氨基酸残基上。 A.天冬氨酸 B.脯氨酸 C.赖氨酸 D.丝氨酸 20.酶促反应的初速度 。
A与[E]成正比 B与[S]无关 C与Km值成正比 D与[I]成正比 E与温度成正比 21.竞争性抑制作用特点是指抑制剂 。
A与底物竞争酶的活性中心 B与产物竞争酶的活性中心 C与底物竞争非必需基团 D与底物竞争辅酶 22.非竞争性抑制作用引起酶促反应动力学的变化是 。
A.Km基本不变，Vm变大 B. Km减小，Vm变小 C. Km不变，Vm变小 D. Km变大，Vm不变 23.重金属Hg、Ag是一类 。
A 竞争性抑制剂 B不可逆抑制剂 C非竞争性抑制剂 D反竞争性抑制剂 24.酶是由生物活细胞产生的，因此它被称为 。
A.无机催化剂 Ｂ.有机催化剂 Ｃ.生物催化剂 Ｄ.离子催化剂 25.L-氨基酸的氧化酶只能催化L-氨基酸氧化，此种专一性为 。
A几何异构专一性 B 旋光异构专一性 C结构专一性 D键专一性 E绝对专一性 26.酶作为催化剂，其作用机理是_____________。
A.降低化学反应的活化能 Ｂ.提高化学反应的活化能 C.提高反应物的自由能 Ｄ.降低产物的自由能 27.与酶的催化机理无关的学说是 。
A.锁钥学说 Ｂ.中间产物学说 Ｃ.诱导契合学说 Ｄ.随机分布学说 28.单体酶不可能含有 。
A.辅助因子 Ｂ.二级结构 Ｃ.三级结构 Ｄ.四级结构 29.结合酶中决定酶特异性的部分是 。
A.金属离子 Ｂ.酶蛋白 Ｃ.辅酶 Ｄ.辅基 30.能够提高酶活性的物质称为 。
A.辅助因子 Ｂ.激活剂 Ｃ.辅酶 Ｄ.辅基
31.二硫基丙醇能够解除有机汞、有机砷化合物对酶的毒性，说明此类重金属抑制剂作用于 。 A -SH B -OH C 磷酸根 D-NH2 E -COOH 32.测定酶活性是要测定酶促反应的初速度，其目的是为了 。
A 节约底物 B 使酶促反应速度与酶浓度成正比 C尽快完成测定工作 D 防止出现产物抑制 E使反应不受温度影响
33.别构酶与不同浓度的底物发生作用，常呈S型曲线，这说明 。 A别构酶是寡聚酶 B别构酶催化几个独立的反应并最后得到终产物
1/v-1 8
C与单条肽链的酶相比，别构酶催化反应的速度较慢 D产物的量在不断增加 E别构酶结合一个底物后，将促进它与下一个底物的结合并增加酶的活力 34.有机磷农药作为酶的抑制剂是作用于酶活性中心的 。
A、巯基 B、羟基 C、羧基 D、咪唑基 35.从组织中提取酶时，最理想的结果是 。
A、蛋白产量最高 B、转换系数最高 C、酶活力单位数值很大 D、比活力最高 36.下列各图属于非竞争性抑制动力学曲线是 。 111[I] [I] VVV[I] 11111O O 1 O
Km?S??S?Km?S?Km
A B C
五、名词解释
全酶（holoenzyme） 具有催化活性的酶，包括所有的必需的亚基、辅基和其它的辅助因子。 酶原（zymogen） 通过有限蛋白水解能够由无活性变成具有催化活性的酶前体。 共价催化（covalent catalysis） 一个底物或底物的一部分与催化剂形成共价键，然后被转移给第二个底物。许多酶催化的基团转移反应都是通过共价催化方式进行的。
酸-碱催化（acid-base catalysis） 质子转移加速反应的催化作用。
酶的活性部位（active site） 酶中含有底物结合部位和参与催化底物转化为产物的氨基酸残基的部分。活性部位通常都位于蛋白质的结构域或亚基之间的裂隙或是蛋白质表面的凹陷部位，通常都是由在三维空间上靠得很近的一些氨基酸残基组成的。
米氏常数（Michaelis constant, Km） 对于一个给定反应，导致酶促反应速度的起始速度（v0）达到最大反应速度（Vmax）一半时的底物浓度。
竞争性抑制作用（competitive inhibition） 通过增加底物浓度可以逆转的一种酶抑制类型。一个竞争性抑制剂通常与正常的底物或配体竞争同一个蛋白质的结合部位。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。 非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition） 抑制剂不仅与游离酶结合，也可以与酶-底物复合物结合的一种酶促反应抑制作用。这种抑制使得Vmax变小，但Km不变。
反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition） 抑制剂只与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合的一种酶促反应抑制作用。这种抑制作用使得Vmax，Km都变小，但Vmax/Km比值不变。
酶的辅助因子(enzyme confactor) 结合酶由蛋白质部分和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白（apoenzyme)，后者称为辅助因子（cofactor)，
辅酶(coenzyme) 某些酶在发挥催化作用时所需要的一类辅助因子，其成分中往往含有维生素。
辅基(prosthetic group) 是与酶蛋白共价结合的金属离子或一类有机化合物，用透析法不能除去。辅基在整个酶促反应过程中始终与酶的特定部位结合。
酶活力(enzyme activeity) 酶催化制定化学反应的能力。 激活剂 凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂
抑制剂(inhibitor) 与酶结合的化合物，通过防止ES的邢成火防止ES生成E+P来抑制酶的活性。
酶的专一性 一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。
诱导契合学说（induced fit ） 酶与底物相互作用，酶和底物都发生变形，底物的结合诱导酶的构象发生
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变化，转变为更有利于与底物过渡态结合的能增强酶催化能力的构象，酶与底物真正互补。 中间产物学说 在酶促反应中，酶首先和底物结合成不稳定的中间配合物（ES），然后再生成产物（P），并释放出酶。反应式为S+E=ES→E+P，这里S代表底物，E代表酶，ES为中间产物，P为反应的产物 六、问答题与计算题
1.从反应活化能、中间产物学说和诱导契合学说等方面说明酶催化化学反应的机制。
酶加快反应速率的本质是降低化学反应活化能，酶能够降低活化能可用中间产物学说来解释。该理论认为，酶催化化学反应时，首先与底物形成不稳定的中间物，然后分解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行，因而加快了反应速度。
酶作用的专一性机制可用诱导契合学说解释。该学说认为酶分子具有一定的柔顺性，由于底物的诱导才形成了使酶与底物之间形成互补形状，与特定的底物之间发生结合，从而促进一种/一类底物的生化反应。 2.简述酶催化的特点和酶作用机理。
酶作用特点包括：①酶具有高效催化性；②酶具有高度专一性；③酶活性在生物体内受到多种因素的调节和控制；④酶对温度和pH的敏感性。
酶催化作用的机理：酶与底物形成不稳定的中间物，然后分解酶与产物而降低反应活化能。酶通过酸碱催化、共价催化、邻近与定向排列等提高反应的速率；通过酶与底物的诱导契合保证其专一性。在同一个酶促反应中，通常会有上述的3个左右的因素同时起作用，称作多元催化。 3.影响酶促反应的因素有哪些？用曲线表示并说明它们各有什么影响？
影响酶活力的因素有很多，包括底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂与抑制剂等。①环境pH值对酶活性影响较大，可能通过影响酶和底物的解离状态，使他们有利于结合或不利于结合，并能改变酶的构象。②温度提高可促进酶蛋白的活性，但随温度提高酶蛋白可能会发生变性而使酶活力降低。③抑制剂可通过多种方式改变酶的活力，如不可逆抑制剂与酶活性中心结合使酶丧失活力，竞争性抑制剂与底物共同竞争酶的活性中心，非竞争性抑制剂与非活性中心结合干扰酶促反应进行，反竞争性抑制阻碍底物与酶的中间物转变为产物与酶。
4.试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。
相同点：都是可逆性抑制剂
不同：（1）竞争性抑制剂结构与酶的底物结构相似，结合位点与底物相同；非竞争性抑制剂与底物结构不同，与底物结合位点也不相同。（2）竞争性抑制剂时酶的Km降低，而Vm不变；非竞争性抑制剂不改变Km，降低Vm。（3）可以通过增加底物降低竞争性抑制剂的作用，而对非竞争性抑制剂则无作用。
5. 1/V对1/S的双倒数作图，的直线斜率为1.2 ×10 3min，截距为2.0×102 ml·min / nmol。计算Vmax和Km。 Vmax=5×10-3nmol/mL min 和Km=6nmol/mL
6. 一种酶分别可被三种浓度相同的抑制剂非竞争性抑制，且抑制程度不同。这三种抑制剂的解离常数分别是：KI1＝0.1mmol·L-1; KI2＝0.01mmol·L-1; KI3＝0.5mmol·L-1。那么造成抑制作用最大的应是哪种抑制剂？为什么？
解答：造成抑制作用最大的是I2。因为KI2＝0.01mmol·L-1最小。根据在非竞争性抑制剂存在下所推导出来的米氏方程： Km[I]11[I]1?(1?)?(1?) VVmaxKi[S]VmaxKi 可以看出，在相通的条件下，值越小者所造成的抑制作用越大。 7. 一个二肽酶对二肽Ala-Gly和二肽Leu-Gly的Km分别为2.8×10-4mol·L-1和3.5×10-2 mol·L-1，哪一个二肽是酶的最适底物？该酶的两个非竞争性抑制剂的Ki值分别为5.7×10-2mol·L-1和2.6×10-4 mol·L-1。哪一个是最强的抑制剂？为什么？
Ala-Gly是最适底物。Km体现酶对底物的亲和能力，Km越小则亲和力越大，是最适底物。
对于非竞争性抑制，使最大反应速度降低（1+Ci/ki）倍，Ki越小，抑制作用越强。
抑制剂存在时Vm降低（1+[I]/ Ki）倍， Ki值越小，抑制作用越大，因此Ki最小的那个是最强的抑制剂。抑制剂的Ki值为2.6×10-4 mol·L-1的抑制作用最强。
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