实验一 质粒DNA的小量制备
（碱裂解法）
一、
实验原理
所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：
①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。
本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。
环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（LDNA），通称L构型。质粒DNA M r一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的M r为1.8×106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管M r相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为LDNA和ocDNA。 二、实验材料与设备 1、用品与仪器
可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），移液吸头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速离心机，旋涡振荡器。 实验材料：含pUC19质粒DNA的大肠杆菌。 2、试剂
LB（Luria-Bertani）培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，用10mol/LNaOH调pH至7.0。高温高压灭菌。
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溶液I：50mmol/L葡萄糖/25mmol/L Tris·HCl（pH8.0）/10 mmol/L EDTA(pH8.0), 高温
高压灭菌(60895×104Pa)15min,贮存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH/1％SDS（临用时配制，可不用灭菌）。
溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAC，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O），钾
离子浓度为3 mol/L，醋酸根离子浓度为5 mol/L。高温高压灭菌。
V（酚）：V（氯仿）=1∶1：酚需在180℃重蒸，加入抗氧化剂8–羟基喹啉，终浓度为0.1﹪，并用Tris·HCI缓冲液平衡至pH＞7.6。氯仿中加入异戊醇［V（氯仿）∶V（异戊醇）=24∶1］。
1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HCI，pH8.0/1mmol/L EDTA/20μg/mL RNaseA。 无水乙醇，70％乙醇，氨苄青霉素贮存液50 mg/ml。 三、实验操作程序 1、 细菌的生长与收获
（1）将3~5 ml含氨苄青霉素（50 μg/ml）的LB加入到容量为15 ml、通气良好的长
玻璃试管中，接入一单菌落，于37℃振荡（350 r/min）培养过夜。
（2）取1.5mL细菌培养物加入Eppendorf管中，以5 000r/min离心2min去掉上清液，
使细菌沉淀尽可能干燥。
2、碱裂解法提取质粒DNA
（1） 将细菌沉淀重悬于100 μl预冷的溶液Ⅰ中，充分分散混悬细菌。
（2） 加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒数次，充分混合，要确保离
心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触，冰浴放置5min。
（3） 加入150 μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物
中分散均匀，冰浴放置5min。
（4） 10 000 r/min离心5min，转移上清液到另一个Eppendorf管中。
（5） 向上溶液加入等体积/酚/氯仿，振荡混匀，以10 000r/min离心2 min，转移上
层水相至新的Eppendorf管中。
（6） 向水溶液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置5 min，以10 000 r/min离心
5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。
（7） 加入1 ml 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，按步骤（6）所述方法弃上清，于空
气中或用电吹冷风使质粒DNA沉淀干燥。
（8） 用20~30 μl含RNaseA酶（20 μg/ml）的TE溶解沉淀，4℃贮存备用。
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3、讨论
（1）．细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA的回收率。理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。
（2）．提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，防止机械剪切，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。 （3）．采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。一般来讲，要将蛋白质尽量除干净，需多次抽提一次，已能达到实验要求。注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。
（4）． 乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法，通常采用冷乙醇（无水乙醇贮存于-20℃），沉淀条件为-20℃，1 h。因本实验为微量快速，室温下数分钟DNA即可沉淀，虽然DNA量少，但纯度相对高（因为低温长时间杂质也一并沉淀下来），有利于以后的酶切及电泳结果。沉淀方法也可用乙丙醇，只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来，这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来，因此需要用70％乙醇很好地洗涤。一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。 四、结果与分析：
1、在提取过程中，溶液出现什么变化（混浊或澄清，是否分层）？有无沉淀产生？ 2、提出的质粒DNA是什么颜色？外观质量如何？
3、实验操作过程中需要注意哪些问题才能得到质量较好的质粒DNA？
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实验二 质粒DNA的酶切
一、实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端： 5'…G↓AATTC…3' 5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' 3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星活力。 二、材料、试剂和仪器 1 材料：质粒DNA
2 试剂：限制性内切酶、ddH2O
3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪
实验程序：取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂，最后用双蒸水补足至10μL，小心
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混匀。37℃水浴保温1—2h，然后各小管内加入1μL的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认真操作。 I. .单酶切：
（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入： 质粒DNA 5 ul ddH2O 3 ul 10×buffer 1 ul
限制性内切酶 1 ul（约10U） 总体积 10 ul （2）混匀，稍离心 （3）37℃水浴1~3hr
（4）70℃水浴10min，中止酶切反应 （5）电泳检测酶切效果 II. 双酶切：
（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入： 质粒DNA 5 ul（约1ug） ddH2O 3 ul 10×buffer 1 ul 限制性内切酶1 0.5 ul 限制性内切酶2 0.5 ul 总体积 10 ul （2）混匀，稍离心 （3）37℃水浴1~3hr
（4）70℃水浴10min，中止酶切反应 （5）电泳检测酶切效果
注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应
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