时间4-5 hr，甚至过夜。限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 三、 结果与分析
假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。
M1 1 2 3 4 5 6 M2
图4 重组质粒HindIII+XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳
分析： M1: λ DNA/ HindIII, M2: DL2000, 1 - 6: 重组质粒HindIII+XbaI. 重组质粒用HindIII+XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。 四、思考题
假设一种内切酶在重组质粒上有两个酶切位点，如果酶切后的电泳显示有三条带，分析可能的原因.
说明DNA限制性内切酶图谱的构建在核酸研究和遗传工程等方面的应用价值。
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实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、目的要求
1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。 2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。 3. 学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。 二、原 理
DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。
表3-1 DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系 琼脂糖凝胶浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
可分辨的线性DNA大小范围/kb 60—5 20—1 10—0.8 7—0.5 6—0.4 4—0.2 3—0.1 7
三、试剂和器材 一）、试剂
1. 酶反应终止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚蓝）：10 μl/组 称取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100 ml。
2. 电极缓冲液（5×TBE）：用前稀释10倍
称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液（0.5×TBE）。 3. 溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/ml）：1滴/组
将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 4. 1%琼脂糖 二）、器材
Eppendorf离心管（1.5ml，预先高温高压灭毒，3个/组）及其离心管架，电泳槽（1个/组），电泳仪（1个/2组），凝胶塑料托盘（1个/组），锥形瓶（100 ml×1，烘干），小烧杯（50，100，250 ml），微量注射器（2 μl×3，15 μl或20 μl×1），一次性塑料手套(64只)，胶头滴管（×3），紫外反射投射仪，防护眼镜，洗瓶2个（分别盛重蒸水和蒸馏水），大烧杯1个，胶头滴管2支，量筒（50 ml×1），卡尺（学生自备） 四、操作方法
一、1.0%琼脂糖凝胶板的制备
1. 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5—1mm的间隙，安置好后保持静置状态。
2. 称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30 mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。
图3-1 凝胶托盘的组
装
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3. 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60℃）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。
4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。 5. 取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3 mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。 二、加样
用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2 μl的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×2×2.5mm）容积约为25 μl，因此加样量不要超过20 μl，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。 三、电泳
加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。当染料带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。 四、观察
小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254 nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。
注意事项
1. 溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用时应带乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经过专门处理后，才能进行清洗或弃去。
2. DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制时急需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染。
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3. 加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同的样品槽模板以形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略小于加样槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。 思考题
1. 名词解释：限制性内切酶；Marker
2. 根据实验结果，解释琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段大小的根据，聚丙烯酰胺凝胶电泳能否测定DNA分子的大小，它们的区别是什么？
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