实验四、PCR技术在农业中的应用（综合性）
利用提取的几种不同农作物品种DNA样品，用3～10个RAPD或SSR引物进行分子标记分析，学会从分子水平研究不同植物扩增DNA片段的遗传多样性。熟悉和掌握PCR技术的原理和方法，并能够使用、掌握相关实验仪器的操作和使用方法。
第一部分:植物DNA的提取与分离
一、目的：
学习并掌握CTAB法提取植物总DNA的原理和操作步骤。 二、原理和方法
关于植物总DNA的提取方法相关文献报道很多，但从提取原理上看主要有二种:CTAB法及SDS法。
1、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol／L NaCl)是可溶的。采用氯仿／异戊醇抽提蛋白质，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当改动后也于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB。用新鲜材料提取时使用2×CTAB缓冲液。
实验需要注意的问题是CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。与SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用，该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA和RNA。 2、SDS（十二烷基硫酸钠）法：
其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度(55～65E)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(量常用的是加 5mol／L的KAC于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。
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三、材料、试剂和仪器
1、试验材料：新鲜或超低温冷冻干燥植物组织0.2g 2、试剂：
2×CTAB提取缓冲液：2g/100ml CTAB, 100mmol/L Tirs·Cl(pH=8.0), 50mmol/L EDTA(pH=8.0)，700mmol/L Nacl(pH=8.0) 无水乙醇，70％乙醇，氯仿，异戊醇。 3、仪器设备：
恒温水浴锅，冰冻离心机，移液器及配套枪头，离心管，研钵 四、步骤
1）取约0.2g新鲜幼嫩叶或黄化苗在含有750ul预热提取缓冲液的研钵中磨碎后转至1.5ml的离心管中，65℃水浴30min,其间轻轻颠倒几次；
2）用等体积氯仿-异戊醇（24：1）轻轻混匀并颠倒约5min左右，然后18℃下10000r/min离心10min；
3）上清液用2倍体积的预冷(-20℃)无水乙醇沉淀， DNA用70%乙醇洗1～2次后,干燥,然后用无离子水溶解后待用或保存在－20℃冰箱中备用。 五、结果与分析
1、DNA提取过程中需要注意哪些问题？
2、DNA提取过程中溶液出现怎样变化？有无颜色、分层和沉淀产生？DNA的颜色、形态如何？
第二部分：DNA的定量分析
一、目的
了解检验DNA定量分析的方法和原理，熟悉检验提取DNA的质量，包括浓度与纯度的具体步骤和操作过程。 二、原理和方法 1、浓度
DNA样品的浓度一般可根据其在260nm的吸收值来确定。50ug／ml的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25 ug ／ml的纯净DNA样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。
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测定时因比色杯最小的容积为0.5ml，微量制备的样品总体积不过20～100ul，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及释释倍数计算出原样品的DNA浓度。 2、纯度
纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8。若OD260／OD280大于1.8，表明样品中有较多的RNA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多，这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除去蛋白质杂质。 三、材料、试剂和仪器
1、实验材料：提取的植物总DNA 2、试剂：超纯水（dH2O）
3、仪器设备：紫外分光光度计，石英比色杯，烧杯、洗瓶 四、步骤
（1）预热分光光度计至少20min。
（2）取两只石英比色杯，一只装入3mldH2O作为空白溶液，校正分光光度计零点和透光度至100。
（3）测定DNA的浓度与纯度：取10ulDNA待测样品，加dH2O稀释混匀至3ml ，将两只比色杯放置在分光光度计中，调整入射光波长分别为260nm、280nm的OD值。（每次用dH2O液调整零点：T＝100、OD＝0）。 （4）DNA浓度与纯度的计算：
DNA样品浓度(ug/ul)=OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000 DNA样品的纯度：OD260／OD280 = OD260 ：OD280 五、结果与分析
DNA定量分析过程中需要注意哪些问题？如何保证测得结果比较正确？
第三部分：RAPD或SSR标记技术
一、目的
学习掌握应用RAPD或SSR技术对植物进行DNA水平的遗传多样性分析。 二、原理和方法
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RAPD标记技术:以基因组 DNA为模板，以10个碱基对的核苷酸序列作引物，通过PCR扩增反应以检测DNA序列多态性
SSR标记技术: 以基因组 DNA为模板，根据微卫星两端特异核苷酸序列设计引物，通过PCR扩增基因组中的重复序列位点，以分析DNA序列多态性。 三、材料、试剂和仪器 (一) RAPD标记技术
1、实验试剂与RAPD反应混合物体系：
10×buffer 2ul 25mM MgCl2 1.6ul 2.5 mM dNTP 1.6ul 引物 3ul(60ng) Taq 酶 0.5 ul (1.25 U) DNA 2ul (80ng) DH2O 9.3 总体积 20ul 2、实验仪器：
PCR仪，移液器，高速离心机、漩涡振荡器，0.2ml、1.5ml离心管 3、反应程序：
（1） 94℃ 3min ;
（2） 94℃ 1min， 37℃ 1min ，72℃ 2min, 35个循环； （3） 72℃ 5min； （4）
4℃下保存待测。
（二）SSR标记技术
1. 实验试剂与RAPD反应混合物体系：
10×buffer 2ul 25mM MgCl2 1.6ul 2.5 mM dNTP 1.6ul 左引物1 2ul (40ng) 右引物2 2ul (40ng) Taq 酶 0.2 ul (1 U) DNA 1.6ul(80ng) DH2O 9.0 ul 总体积 20ul
2. 实验仪器：
PCR仪， 移液器，漩涡振荡器，0.2ml离心管 3. 反应程序：
（1） 94℃ 3min；
（2）
94℃ 1min， 55℃ 1min ，72℃ 2min, 35个循环；
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（3） （4） 四、步骤
72℃ 5min； 4℃下保存待测。
1. 从－20℃冰箱中拿出DNA模板以及药品MgCl2 ，Taq酶，Buffer缓慢解冻（冬季直接在空气中解冻，夏季在4℃冰箱中或冰盒上解冻）。
2. 按照RAPD或SSR反应体系与实验目的，配制缺少DNA模板或RAPD或SSR引物的反应液混合物于0.5ml离心管中（注意：Taq酶在分装前的最后才从－20℃冰箱中取出，加入反应混合液中）混匀离心。
3. 分装反应液于0.2ml离心管后，按照实验的需要加入DNA模板或者RAPD引物，然后再次混匀后离心，接着用石蜡油封盖液体以防挥发。
4. 将装有反应体系的离心管放入，PCR仪的小孔中，开始按反应程序进行PCR（链式聚合酶反应）扩增
注意：1）两次混匀、离心都很重要，能够直接影响扩增的结果。
2）反应体系覆盖石蜡油必不可少，否则反映体系混合液会在高低温循环挥过程中发殆尽。 五、结果
记录扩增样品数量，循环次数和扩增时间。
(四 ) 琼脂糖凝胶电泳检测
一、目的
学习掌握应用琼脂糖凝胶电泳的原理及操作，并对PCR的扩增结果或者DNA的质量进行检测。 二、原理和方法
由于DNA在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，在电泳过程中DNA通过凝胶分子筛向正极端移动。迁移率与DNA分子的构型和大小相关，与DNA分子中的碱基组成和顺序无关。电泳结束后，用溴化乙锭染色。溴化乙锭与DNA的络合物在一定波长的紫外光照射下会发出红色荧光，由此可观察到DNA在凝胶中所处的位置。 三、材料、试剂和仪器
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1×TAE电泳缓冲液，琼脂糖，EB（溴化乙锭），三角瓶，做胶托盘，电泳槽，电泳仪，微波炉，电子天平，0.25％溴酚蓝加样缓冲液，胶梳 四、步骤
1) 称取适量琼脂糖在三角瓶中，按照胶的浓度加入1×TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解至完全透明。
2) 待冷却至60℃左右，加入终浓度为0.5ug/ml的EB，混匀。
3) 将胶床水平放置插好梳子，倒入琼脂糖凝胶溶液，梳子插入胶中3～5mm左右，放置30～60min，待凝胶完全凝固硬化。
4) 待检验PCR扩增产物中加入， 0.25％溴酚蓝加样缓冲液1～2ul，稍微离心。 5) 小心拔出梳子，检查样品孔完整性，样品孔中加入扩增后样品。 6) 将胶床，放入电泳缓冲液中，以5V/cm电压电泳。
7) 溴酚蓝泳动至胶3/4处时停止电泳，取出凝胶，在短波紫外线（254nm）下观察。
注意：记录点样顺序。
五、结果
记录扩增样品数量、电泳时间，条带的明亮度、多态性和模式图。
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