实验三、质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定
1．仪器
台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、冰箱、电子秤量器、摇床、离心管、枪头、乳胶手套等
2．材料
JM109大肠杆菌细胞、pMD 18-T 载体、含有猪MC1R基因的pMD 18-T重组质粒、猪MC1R基因插入片断和DGL2000分子量标记。
3．溶液及试剂
1）化学试剂
TE 缓冲液、溶液I（GET）、溶液II（裂解液）、溶液III（乙酸钾）、Tris饱和酚、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、70%乙醇、乙醇 2）细菌培养类试剂
LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal 3）酶类
EcoRI、PstI限制性内切酶、RNA酶 4）电泳类试剂
1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶
4．操作步骤
1.质粒DNA的提取（碱法）
1）培养质粒：在LB固体培养基中，用灭菌枪头挑选含有猪MC1R基因的pMD 18-T重组质粒的大肠杆菌（JM109）单克隆，接种到含有氨苄青霉素（50ug/mL）的LB液体培养基3ml中，37℃震荡培养8h～16h。
2）取液体培养基1.5mL于1.5ml离心管中，转速12,000/min离心15sec，去上清夜，加入100uL含有RNA酶的溶液I（GET），充分混匀后在室温下放置5min。 3）加入200uL新配置的溶液II（裂解液），立即颠倒5～10次，使细菌裂解，室温放置2min。
4）加入350uL溶液III（乙酸钾）溶液，颠倒5～10次，使其充分中和，室温放置2min。
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5）用台式高速离心机，转速为12,000r/min离心5min，将上清夜移入另一干净1.5ml离心管中。
6）加入700uL酚氯仿溶液（1:1），震荡混匀，12,000rpm离心5min，取上层液至另一干净离心管中。
9）加入700ul 异丙醇，震荡混匀，在室温下静置2min，15,000r/min离心8min，弃上清夜。
10）离心管中加入1mL 70%冷乙醇，用漩涡振荡器将沉淀悬浮洗涤30sec，15,000r/min离心5min，弃上清夜。 11）在室温下使沉淀自然干燥（约30min）。
12）待沉淀完全干燥后，加入30ul TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解沉淀，4℃放置30分钟以上，使DNA充分溶解，-20℃保存备用。
2．质粒DNA的酶解
用EcoRI和PstI双酶解提取的重组质粒DNA，可获得2.6kb的质粒DNA片断和0.5kb的插入片断。
4）酶解反应液的配制（总体积30ul） 按以下顺序在0.5ml离心管中加入试剂： 试剂 灭菌水
1× 14ul
2× 28ul 6ul 3ul 3ul 40ul
4× 56ul 12ul 6ul 6ul 60ul
8× 112ul 24ul 12ul 12ul 160ul
10×酶解缓冲液 3ul EcoRI (10U/ul) 1.5ul PstI (10U/ul) 合计
1.5ul 20ul
按每管20ul分装，每管加入新提取的质粒DNA 10ul
2）将配制好的酶解反应液放置恒温培养箱37℃酶解过夜（8h～16h）。
3．电泳检测
1）1%琼脂糖凝胶的配制
称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE工作液，混匀后将该三角瓶
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置于微波炉加热煮沸10sec，加入20ul（约一滴）溴化乙锭（1mg/mL），混匀后室温降温至50℃左右。用挡板封住胶板，在固定位置放上梳子，将凝胶缓慢倒入胶板，室温下静止30min左右，待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子。拔掉挡板，将凝胶板放入含有TBE缓冲液的电泳槽中。 5）点样
取5ul提取的质粒DNA及5ul酶解后的质粒DNA，分别与适量的溴酚篮（样品的1/5）混匀后，点入凝胶孔内。同时将分子量标记5ul（DGL2000）也点入凝胶第一孔位置内。
注：DGL2000分子量标记分别是：2000bp, 1600bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp。 6）电泳
接通电源后，将电泳仪的电压调至100V，电泳2小时左右，溴酚篮移动距点样孔3cm左右，停止电泳。 7）观察和拍照
将凝胶从凝胶板上取下，放到紫外观察箱中，打开紫外观察灯254nm，可见到分子量3.1kb的质粒DNA和2.6kb与0.5kb的质粒酶解片断。凝胶DNA的拍照采用凝胶成像仪（在植病重点实验室进行）。
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实验四、DNA片断的纯化与定量
1．仪器
台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温水浴锅、电子秤量器、离心管、枪头、乳胶手套等 2．材料
pMD18-T 线性质粒(2.6kb)、猪MC1R基因的插入片断（0.5kb）、DGL2000分子量标记、单面刀片等。
3．溶液及试剂
UNIQ-10柱式DNA胶回收与纯化试剂盒 2）电泳类试剂
1×TAE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶
4．操作步骤
1．纯化线性质粒2.6kb与插入片断0.5kb（实验一酶解所得），采用DNA快速纯化/
回收试剂盒（上海生工）
1）电泳：制备1%琼脂糖凝胶，用TAE缓冲液和大孔梳子制胶，将实验一酶解质粒产物（30ul）与4ul溴酚篮混匀后点样至点样孔内，同时点入5ul DGL2000分子量标记。100V电泳2h后，在紫外灯下可见一条2.6kb的线性质粒和0.5kb的插入片断。
2）用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中。判定DNA片段的位置时尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。在紫外观察灯下，用单面刀片切取含2.6kb线性质粒和0.5kb插入片断的琼脂糖凝胶（在保证全部切取DNA片段的前提下，切取的琼脂糖凝胶应尽可能小），将该凝胶放入1.5ml离心管内，称重。
3）按每400μl/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer,置于50︿60oC水浴中10分钟，使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。
4）将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。8000rpm离心1分钟。
5）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，
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加入500μl Wash Solution,8000rpm室温离心1分钟。 6）重复步骤4一次。
7）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm离心30秒。
8）将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水(PH>7)，室温或37oC放置2分钟。
9）12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20oC备用。
2．DNA片段的定量
方案一：电泳法与标准分子量marker比较。
1）制备好凝胶后，在点样孔点入5ul分子量标记（DGL2000），取所需定量的DNA样品1ul和2ul分别加入9ul和8ul TE，与适量的溴酚篮（2ul）混匀后点入点样孔。
2）100V电泳2h，在紫外灯下比较需定量的DNA片段与分子量标记条带的亮度，推算纯化的DNA片段的浓度。
3）分子量标记（2000bp, 1600bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp）每条带的浓度约为50ng。
4）取1ul和2ul样品估测的平均数即为DNA片段的定量结果。 方案二：用核酸/蛋白定量仪进行定量（具体操作结合仪器讲解）。
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