在恒温培养箱37℃ 4h 以上。 4）电泳检测
用1.5%的琼脂糖胶检测（胶的配制及电泳方法与实验一相同），取全部20ul 酶切产物与适量溴酚篮（4ul）混匀后电泳。
16
实验八、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）
1．仪器
台式高速离心机、PCR基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、离心管、枪头、乳胶手套等。
2．材料
猪基因组DNA（15ng/ul）。
3．溶液及试剂
1)引物
单条随机引物S357（上海生工生物工程技术服务有限公司） S357：ACGCCAGTTC 2）化学试剂
10×PCR buffer，MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油 3）Taq酶
Taq酶(5U/ul)购自上海生工生物工程技术服务有限公司， 4）电泳类试剂
1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶
4．操作步骤
1）按以下顺序配制RAPD反应混合物（总体积10ul）
dH2O 10×Buffer 2+Mg (25mM) S357 (10nM) dNTP (20 mM) Tag (5U/ul) Total in each 1× 5.5 1 0.8 0.4 0.2 0.1 8 2× 11 2 1.6 0.8 0.4 0.2 16 5× 27.5 5 4 2. 1 0.5 40 按每管8ul分装后，分别加模板DNA 2ul (30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆盖反应混合物，防止液体挥发。
2）RAPD反应条件
17
预变性：94℃ 3min 变性：94℃ 1min
退火：36℃ 1min 40 cycles 延伸：72℃ 1.5min 后延伸：72℃ 8min 3）电泳检测
用1.5%的琼脂糖胶检测（胶的配制及电泳方法与实验一相同），取10ul RAPD产物与适量溴酚篮（2ul）混匀后电泳。
18
实验九、微卫星DNA技术MIC-DNA
1．仪器
台式高速离心机 PCR基因扩增仪 电泳仪 微量移液器 凝胶成像系统 离心管 枪头 乳胶手套 竖式电泳槽 枪头 手套 移液管 透明胶 水平脱色摇床 染色盘
2．材料
猪基因组DNA（15ng/ul）。
3.溶液及试剂
1)引物
上游引物SWR136F: TTCTCTGCCGTCACTCACTG 下游引物SWR136R: CTGGGACCCTCCATATGATG 2）化学试剂
10×PCR buffer，MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油， 丙烯酰胺， 10%过硫酸铵(用前配制)， 甲醛， 无水乙醇， HNO3 ， AgNO3， Na2CO3 HAc， Na2S2O3 ， TEMED ， 琼脂糖。 3）Taq酶
Taq酶(5U/ul)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
4）溶液（配置见附页）：前处理液 固定液 染色液 显影液 定影液 5xTBE 6x蔗糖缓冲液
4．操作步骤
（一）PCR反应
1）按以下顺序配制PCR反应混合物（总体积10ul）
dH2O 10×Buffer 2+Mg (25mM) SWR136F(10nM) SWR136R(10nM) dNTP (10 mM) Tag (5U/ul) 合计 1× 5.5 1.0 0.6 0.3 0.3 0.2 0.1 8 10× 55 10 6 3 3 2 1 80
19
按每管8ul分装后，分别加模板DNA 2ul (约30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆盖反应混合物，防止液体挥发。
2）PCR反应条件 预变性：94℃ 3min 变性：94℃ 30sec
退火：56℃ 30sec 40 cycles 延伸：72℃ 30sec 后延伸：72℃ 5min
（二）制胶
1）用胶带和1%的琼脂糖封闭玻璃板与垫片间的缝隙
2）用移液管取30%丙烯酰胺13.35ml于小烧杯中，加入5XTBE10 ml,定容至50ml 3）向烧杯中加入350μl过硫酸铵和25μlTEMED混合后，立即灌胶。 4）然后插梳子，聚合1h （三）上样、电泳
1）凝胶聚合后，拔出梳子，并用去离子水洗点样孔； 2）加电泳工作液； 3）点样；
4）电泳：接通电源(150V 1h或小电压过夜) （四）染色
1）玻璃板的分离 电泳结束后，关闭电泳仪，小心地揭开玻璃板，将凝胶剥离后放入已准备好的入有双蒸水的干净的瓷盘中，将瓷盘放在摇床上轻摇1min 2）凝胶的固定 倒掉瓷盘中的水，加入固定液，在摇床上缓缓摇动15min 3）洗胶 倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗2次，共计1min
4）凝胶的氧化 倒掉瓷盘中的水，加入前处理液氧化化，在摇床上缓缓摇动15min 5）洗胶 倒掉瓷盘中的前处理液，用双蒸水洗2次，共计1min
6）凝胶的染色 倒掉瓷盘中的水，加入染色液，在摇床上缓缓摇动20min 7）洗胶 倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗2次，共计1min
8）凝胶的显影 加少量显色液冲洗15s，再加一定体积显色液，轻摇瓷盘直到
20