实验五、重组DNA分子的构建、筛选与鉴定
1．仪器与耗材
台式高速离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温水浴锅、摇床、培养皿、离心管、枪头、乳胶手套等
2．材料
纯化后的pMD 18-T 线性质粒(2.6kb)、纯化后的猪MC1R基因的插入片断（0.5kb）、DGL2000分子量标记。
3．溶液及试剂
1）细菌培养类试剂
LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal 2）酶类 T4 DNA连接酶 3）电泳类试剂
1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶
4．操作步骤
1． 重组DNA分子的构建
1）用灭菌水将实验二纯化的线性质粒DNA（2.6kb）和DNA插入片段（0.5kb）稀释至20ng/ul左右
2）按以下反应体系配制连接反应
插入片段:质粒1×
(3:1) 灭菌水
10×连接缓冲液 线性质粒 插入片段 T4 DNA连接酶 总体积
11
插入片段:质粒1×
(1.5:1)
6ul 1ul 1ul 1ul 1ul
灭菌水 10×连接缓冲液 线性质粒 插入片段 T4 DNA连接酶
5ul 1ul 2ul 1ul 1ul 10ul
10ul 总体积
3）在室温（22℃左右），反应2h以上。
2、细胞转化
1) 在冰上溶解50ul感受态细胞JM109.
2) 待细胞溶解后，加入5ul连接反应液（约2ng/ul），轻微指弹混匀，不可剧烈震荡。
3）在冰中放置30min。 8）42℃水浴锅中放置45sec. 9）立即移入冰中放置2min. 10） 11）
3．重组子的检测
1）制备含氨苄青霉素的LB固体培养基平板：在500ml试剂瓶中，加入7.5g细菌培养用琼脂粉与500ml已配制的LB液体培养基，高压灭菌，待液体冷却至55℃左右时（瓶底不烫手背），加入500ul氨苄青霉素（50mg/ul），混匀后适量（约30ml～50ml）倒入培养皿中，静置直到液体凝固为止（约2h左右）。
2）在平板表面加入X-gal 20ul和IPTG 4ul，用无菌玻璃涂棒将试剂均匀涂布于整个平板表面，置37℃ 1h 直至所有液体蒸发。
3）取50ul和250ul细菌培养液加在平板的表面，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布于整个平板表面，将平板放置于37℃培养15min，至液体被吸收。 4）倒置平板于37℃培养12h～16h，可出现菌落。
5）于4℃将平板放置1h，使蓝色充分显色。用灭菌牙签挑选单个白色菌落置2ml LB液体培养基（含氨苄青霉素）中，37℃摇床培养8h～12h。
12
加入预先保存在37℃的SOC培养基940ul. 37℃振荡培养1h.
实验六、PCR扩增DNA技术
1．仪器
台式高速离心机、PCR基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、离心管、枪头、乳胶手套等。
2．材料 猪基因组DNA（15ng/ul）。 3．溶液及试剂
1)）引物
PCR扩增哺乳动物磷酸酯转移蛋白基因（PLTP） 上游引物PLTPF2: TGAAGGGTAGGACAAGACAG 下游引物PLTPR1: GTTGAGGAGGAAGCGCATC 2）化学试剂
10×PCR buffer，MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油 3）Taq酶（购自上海生工）5U/ul 4）电泳类试剂
1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶
4．操作步骤
1）按以下顺序配制PCR反应混合物（总体积25ul）
dH2O 10×Buffer 2+Mg (25mM) PLTPF2 (10nM) PLTPR1(10nM) dNTP (10 mM) Tag (5U/ul) 合计 1× 16.8 2.5 1.5 0.75 0.75 0.5 0.2 23 2× 33.6 5 3 1.5 1.5 1 0.4 46 5× 84 12.5 7.5 3.75 3.75 2.5 1 115
按每管23ul分装后，分别加模板DNA 2ul (约30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆盖反应混合物，防止液体挥发。
2）PCR反应条件
13
预变性：94℃ 3min 变性：94℃ 45sec
退火：58℃ 45sec 40 cycles 延伸：72℃ 45sec 后延伸：72℃ 5min 3）电泳检测
用1%的琼脂糖胶检测（胶的配制及电泳方法与实验一相同），取5ul PCR产物与适量溴酚篮（1ul）混匀后电泳。
14
实验七、PCR扩增产物的限制性长度多态性（PCR-RFLP）
1．仪器
台式高速离心机、PCR基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、离心管、枪头、乳胶手套等。
2．材料
猪基因组DNA（15ng/ul）。
3．溶液及试剂
1)）引物
PCR扩增哺乳动物磷酸酯转移蛋白基因（PLTP） 上游引物PLTPF2: TGAAGGGTAGGACAAGACAG 下游引物PLTPR1: GTTGAGGAGGAAGCGCATC 2）化学试剂
10×PCR buffer，10×HaeIII buffer, MgCl2（25mM），dNTPs（10mM），石蜡油
3）Taq酶与限制性内切酶HaeIII
Taq酶（5U/ul）与限制性内切酶HaeIII（10U/ul）（上海生工）。 4）电泳类试剂
1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液（EB）、琼脂糖凝胶
4．操作步骤
1）PCR扩增猪PLTP基因（条件与实验六相同）。 2）酶切反应
按以下顺序配制酶切反应混合物（反应总体积20ul） 反应物 灭菌水 10×酶解缓冲液
1× 13ul 2ul
2× 26ul 4ul 2ul 32ul
4× 52ul 8ul 4ul 64ul
HaeIII (10I/ul) 1ul 合计
16ul
按每管16ul分装，分别加PCR产物4ul(约100ng)。 3）酶切反应条件
15