实验二 喷雾干燥酶粉中分离筛选1398中性蛋白酶生产菌株
（选做）
一、实验目的要求
掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基的制备，灭菌等无菌操作技术。 二、实验原理
中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。比值大的其产酶活力明显增大。 三、材料与方法 1、试验材料
供试材料为喷雾干燥的中性蛋白酶样品。购自市场。
2、培养基
（1）干酪素培养基：干酪素2.0％（用适量NaOH溶液加热溶解），琼脂1.5％，pH7.0（或干酪素 4g，硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，硫酸铁 0.01g，蔗糖 30g，琼脂20g，1000mL）。
（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.4％，蛋白胨0.6％，酵母浸出粉0.2％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，pH7.0 （3）发酵培养基Ⅰ：麸皮4.0％，蛋白胨0.1％，Na2HPO4·12H2O 0.4％，KH2PO4 0.03%，pH7.0。
发酵培养基Ⅱ：可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.5％，Na2HPO4·12H2O 0.4%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH7.0。
3、仪器与设备
超净工作台，恒温培养箱，恒温振荡培养箱，恒温水浴锅，台式低速离心机，721型分光光度计 4、步骤 （1）初筛
利用样品通过常规稀释平板法：即取10 g样品置于已加入90mL无菌水的三角瓶中，220 r／min旋转摇床，20 min后取出，静置30 s。
此三角瓶中液体的浓度为10-1，再用7支分别装有9 mL无菌水的试管进行稀释，稀释至10-8。
将干酪素培养基分别倒入已灭菌的6个平皿中，每个平皿倒入10 mL左右，然后吸取0.1 mL的10-6，10-7，10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面，每个稀释浓度涂布2个平皿。37 ℃培养24 h。肉眼选出产生透明圈的菌株。
将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿（每个平皿倒10mL左右，置平板）和7支试管（每支试管6mL左右，置斜面）内。然后将选出来的若干株菌在平皿上划线，每株划一个平皿。37 ℃培养24 h。取出，然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管（每个平皿对应一支斜面试管）进行活化培养，37 ℃培养24 h。 （2）复筛
面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基Ⅰ的三角瓶中进行发酵培养。30 ℃恒温振荡培养48 h，3500r／min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。用发酵培养基Ⅱ进行发酵培养，30 ℃恒温振荡培养48 h，3500 r／min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力最高的1株。
5、蛋白酶活力的测定 （1）原理
采用福林-酚试剂法。福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度计在660 nm处测定，从而计算出蛋白酶活力。 （2）试剂 福林-酚试剂
在2000mL磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700mL蒸馏水，再加50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入50g 硫 酸 锂（Li2SO4），50mL蒸馏水及数滴浓溴水（99％），开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加浓溴水的步骤）。定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。此溶液使用时加两倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g ，加去离子水定容至1000 mL。 0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4 g，加去离于水溶解后，定容至1000 mL。 pH7.2磷酸盐缓冲液
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液(B液)。
取A 液28 mL 和B 液72 mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1 mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液。 2%酪蛋白溶液
准确称取干酪素2 g，称准至0.002 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠10 mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 100 μg/mL酪氨酸溶液
精确称取在105 ℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，用1 mol／L盐酸溶液60 mL溶解后，用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
吸取1 mg／mL酪氨酸标准溶液10 mL，用0.1 mol／L盐酸溶液定容至100 mL，即得到100μg/mL的酪氨酸标准溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 （3）酪氨酸标准曲线的绘制
取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按下表分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4 moL/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660 nm)，以浓度为0 μg/mL酪氨酸反位液做空白对照。 管号 1 2 3 4 5 6 标准酪氨酸 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 去离子水 (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Na2CO3 (mL) 5 5 5 5 5 5 福林一酚试剂 (mL) 1 1 1 1 1 1 酪氨酸含量 (μg/mL) 0 20 40 60 80 100 （4）样品酶活力的测定 取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL，1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入1 mL pH 7.2、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH 3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40 ℃恒温水浴准确计时，保温10 min后，立即加入0.4 moL/LTCA溶液2 mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1 mL 2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20 min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1 mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL和己稀释的福林-酚试剂1 mL，摇匀，保温显色20 min后，进行比色测定(波长660 nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
（5）蛋白酶活力计算： 蛋白酶活力=A×4×N/10。
式中：A表示对照标准曲线得出的酪氨酸释放量；4表示反应液总体积；N表示酶液的稀释倍数；10表示反应时间10 min；蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH 7.0)和40 ℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
思考题： 某菌株的透明圈的大小可以完全反映该菌株的蛋白酶活力大小吗？说明理由。
实验三 黑曲霉三角瓶固态发酵实验
一、概述
固体发酵法作为一个古老的生物工艺早在几千年前已在食品和调味品上得到应用。与液体发酵相比，固态发酵操作简易、工艺简单、能耗低，无废水废渣产生，不造成对环境的二次污染。因此，固态发酵法目前在生产有机酸、发酵食品、酶制剂以及动植物废弃物、垃圾的处理和利用等方面有着广泛的应用。利用曲霉属菌种，通过固体或液体发酵法生产酸性蛋白酶，我国在七十年代末和八十年代初作过一些研究，但此后有关这方面研究的报导极少见到。近年来，随着酸性蛋白酶应用范围的扩大，尤其是作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出来的潜在功能，越来越引起人们对它的研究兴趣。
二、实验目的与要求
通过三角瓶固态培养黑曲霉，掌握固态培养微生物的原理和技术，并掌握蛋白酶的分析方法。
三、菌种和培养基
1、 菌种：
黑曲霉（上海华东理工大学赠送） 2、培养基：
（1）斜面培养基
土豆培养基或察氏培养基。（土豆培养基：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。）
（2）固态发酵培养基
麸皮 8g，豆饼粉 2g，(NH4)2SO2 0.2g，水11mL，121℃灭菌45分钟。
四、仪器与设备
三角瓶100个、普通天平4个，分析天平1台，灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台
接种铲8个，100mL量筒8个，10mL移液管8支，塑料盆8个
五、实验过程
原始斜面菌种→斜面接种培养（28℃、7天）→麸皮试管培养（28℃、7天）→三角瓶培养(28℃、72h)→测定酸性蛋白酶酶活力，观察孢子形态。
固态发酵培养基灭菌后将培养基拍散，冷却至室温，接入麸皮试管种子，混匀，于恒温培养箱中28-30℃静置培养72小时，取样测定酶活力。 实验分四组：
①组：装料量对酶活力的影响。取5×3（2）个250mL三角瓶，按以上固态发酵培养基，分别按下列装料量（按干料计算）装料：5g/瓶；10 g/瓶；15 g/瓶；20 g/瓶；25 g/瓶。接种培养72小时后，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
②组：碳氮比对酶活力的影响。取5×3（2）个250mL三角瓶，麸皮和豆饼粉的比例按下列配比：6:4；7:3；8:2；9:1；10:0。接种培养72小时后，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
③组：料水比对酶活力的影响。取5×3（2）个250mL三角瓶，麸皮和豆饼粉的比例按给出的固态发酵培养基，但料水比按以下比例配制：10:8；10:9；10:10；10:11；10:12，接种培养72小时后，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
④组：酶活力的时间变化曲线。取5×3（2）个250mL三角瓶，麸皮和豆饼粉的比例按给出的固态发酵培养基，接种培养，分别于接种后24、36、48、60、72小时取样，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
实验四 黑曲霉固态发酵曲的酸性蛋白酶活力测定（承接试验三）