实验五 土霉素摇瓶发酵实验（设计型实验）
一、实验目的：
1、熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技术 5、掌握分光光度法测定发酵样品土霉素效价的方法 二、实验原理
土霉素是四环类抗生素，其在结构上含有四并苯的基本母核，随环上取代基的不同或位置的不同而构成不同种类的四环素类抗生素。其结构和命名如图。
土霉素 四环素 金霉素 去甲基金霉素 多西环素 米诺环素 美他环素 R1 H H Cl Cl H N(CH3)2 H R2 OH OH OH OH H H =CH2 R3 CH3 CH3 CH3 H CH3 H ? R4 OH H H H OH H OH R5 H H H H H H CH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2 R 1R 2R H 3R 4H N CH 3 CH 3 OH HR N 5OH O OH OH O O 土霉素具有广谱抗菌性，能抑制多种细菌、较大的病毒及一部分原虫。土霉素能抑制细菌的生长，在浓度高的时候也具有杀菌的作用。它的作用机制是干扰
蛋白质的合成。由于它的毒副作用小，所以其在医疗上用途广泛，主要是应用于呼吸道和肠道感染。
土霉素是由龟裂链霉菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，它们具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.4～1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分，孢子丝再形成分生孢子。而龟裂链丝菌的菌落灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。
土霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。龟裂链丝菌的生长和土霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵pH值、溶氧、接种量、泡沫等。同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、ATP的调节和产生菌生长速率的调节等。
三、仪器与材料
（一）培养基
1、斜面高氏一号培养基(100mL灌装斜面若干支)
可溶性淀粉2% 氯化钠0.05%(配成1%溶液，使用时5mL/100mL) 硝酸钾0.1% 三水磷酸氢二钾0.05%(配成1%溶液，使用时5mL/100mL)
七水硫酸镁0.05%(配成1%溶液，使用时5mL/100mL) 七水硫酸亚铁0.001%(配成1%溶液，使用时0.1mL/100mL) 琼脂1.5%-2.0% pH：7.4-7.6
2、母瓶培养基
淀粉3%(1.5g/50mL) 黄豆饼粉0.3%(0.15g/50mL) 硫酸铵0.4%(0.2g/50mL) 碳酸钙0.5%(0.25g/50mL) 玉米浆0.4%(0.2mL/50mL) 氯化钠0.5%(0.2g/50mL) 磷酸二氢钾0.015%(配成1%溶液，使用时0.75mL/50mL) pH：7.0-7.2
3、发酵培养基
淀粉15%( 7.5g/50mL) 黄豆饼粉2%(1g/50mL) 硫酸铵1.4%(0.7g/50mL) 碳酸钙1.4%(0.7g/50mL) 氯化钠0.4%(0.2g/50mL) 玉米浆0.4%(0.2mL/50mL) 磷酸二氢钾0.01% (配成1%溶液，使用时0.5mL/50mL) 氯化钴10μg/mL(配成1mg/mL溶液，使用时0.5mL/50mL) 消沫剂0.01% 淀粉酶0.1%-0.2%(0.1g/50mL) pH7.0-7.2
（二）实验菌种：龟裂链霉菌，本实验室保藏
（三）仪器：玻璃试管（18×180）、试管架8、吸管（1mL，2mL，10mL）、吸耳球、离心管（7 mL）、容量瓶、烧杯、三角瓶360个（250 mL）、量筒（250mL，500mL，1000mL）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、恒温摇床、恒温箱、台秤等 四、实验题目
1、溶氧对土霉素发酵的影响：取4×3个250mL的三角瓶，培养基装量： 30mL/250mL；40mL/250mL；50mL/250mL；60mL/250mL。接种后的发酵瓶于30℃恒温室摇床上摇6～7天，转速为230转/分。测定发酵液的效价。
2、培养基中磷量对土霉素发酵的影响：取5×3个250mL的三角瓶，培养基装量50mL/250mL，培养基中磷酸二氢钾的含量分别为：0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.1%。培养后测定发酵液的效价。取三个平行样的平均数。
3、接种量对土霉素发酵的影响。取5×3个250mL的三角瓶，培养基装量50mL/250mL，接种量分别设计为：2%、5%、10%、15%、20%。培养后测定发酵液的效价。取三个平行样的平均数。
4、碳源、氮源浓度对土霉素发酵的影响：取6×3个250mL的三角瓶，培养基装量50mL/250mL。淀粉10%、淀粉15%、淀粉20% ；黄豆饼粉1%、黄豆饼粉2%、黄豆饼粉3%。培养后测定发酵液的效价。取三个平行样的平均数。 五、实验步骤
1．斜面孢子的制备
无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.5～37℃的恒温箱培养3天，再置30℃的恒温室培养1天。
2．种子的制备
（1）摇瓶种子培养基的配制
按母瓶培养基成分配比，配制培养基，并加淀粉酶液化后，再加入CaCO3，冷却后调pH值，分装，包装灭菌。
（2）接种
在超净工作台上，将长好的斜面孢子用无菌接种铲挖块约2cm2，接种于灭过
菌的摇瓶种子培养基中。
（3）培养
将接种好的种子摇瓶于30℃恒温室摇床上，转速为230转/分，培养28小时左右。
3．发酵
（1） 发酵瓶培养基的配制
培养基配方以发酵培养基配方为基础，依据实验题目不同而设计。摇瓶装量依据实验题目而设计。制备方法同种子瓶。
（2） 接种
在超净工作台上，将培养28小时的摇瓶种子接种于发酵瓶中，接种量一般为10%或依据实验题目而设计。
（3）培养
将接种后的发酵瓶于30℃恒温室摇床上摇6～7天，转速为230转/分。 六、实验报告
写出实验方案、具体实验方法和实验过程。 七、思考题
1.为什么种子摇瓶培养28小时左右？
2.分析发酵培养基成分，龟裂链霉菌发酵土霉素的碳源和氮源有哪些？ 3.培养基加淀粉酶的目的是什么？消沫剂的作用是什么？为什么摇瓶发酵培养基可以不加消沫剂？
关于淀粉液化：
1.酶法液化原理：
淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。 2.淀粉液化方法：
配制15-30％的淀粉乳，调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至80-90℃，并维持30-60min，以达到所需的液化程度。