实验六 土霉素摇瓶发酵的效价测定（设计型实验）
一、实验原理
关于四环素族类抗生素的测定，目前多用微生物测定法及高效液相色谱法。 可用的物理化学方法有： FeCl3 比色法、盐酸比色法、紫外分光光度法、荧光法及近年内文献所报道的用流动注射分析法（ FIA ）。
土霉素化验采用可见光分光光度法测定。土霉素在酸性条件下，能与FeCl3作用生成橙褐色的物质，根据有色物质对光的吸收定律，在480 nm处测定样品的吸光度，然后对照标准浓度---吸光度曲线，以计算土霉素的浓度。
土霉素与金属离子生成有色配位化合物
OOHOHOOFCae2+ OOH
OHO盐酸四环素 盐酸金霉素 盐酸土霉素 盐酸多西环素
二、实验步骤
（一）发酵液状态观察：
粘度、颜色、气味、菌丝形态 （二）发酵样品预处理：
FeCl3
红棕色 深褐色 橙褐色 褐色
发酵瓶摇匀，将少量倒入小烧杯，测pH。用9mol/L的盐酸溶液酸化pH至1.7-2.0搅拌10分钟。取5mL酸化液至7mL离心管，6000转离心4分钟，取上清液，备测。
（三）发酵样品土霉素效价的测定：
采用分光光度法测定其效价。 1.土霉素标准曲线的绘制：
将土霉素标准样用0.01mol/L的盐酸配成1000u/mL的标准液。
用2mL移液管分别取标准液0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL于七支试管中，加0.01mol/L的盐酸使全量均为10mL。再向每支试管中加0.05%（g/mL）的三氯化铁溶液10mL，摇匀，静置20分钟。另取样同上，加0.01mol/L的盐酸使全量为20mL，摇匀，作为空白，在480nm的波长下测定吸光度值。以土霉素效价为纵坐标，以吸光度值为横坐标绘制作标准曲线。 2.发酵液效价的测定：
用移液管吸取适宜稀释倍数（使稀释后效价在标准曲线范围内）的滤液1mL稀释液于试管中，准确加入0.01mol/L的盐酸，使全量为10mL。再加入0.05%（g/mL）的三氯化铁溶液10mL，使全量为20mL。另取一支试管，加入1mL稀释液，再加入0.01mol/L的盐酸19mL，使全量为20mL，摇匀，放置20分钟，作为空白。在480nm的波长下测两种液体的吸光度。 三、实验报告
1.自己设计表格记录实验数据。 2.用图、表汇总实验结果。 3.对实验结果作出分析和讨论。 四、思考题
1、写出土霉素发酵工艺流程图。
2、通过查阅资料，试述次级代谢产物的发酵规律和代谢调节机制。
试剂配制如下表
试剂名称 10%（g/mL）三氯化铁溶液 配置方法 称取三氯化铁500g（FeCl3?H2O称830克）用少量蒸馏水溶解过滤，加浓盐酸30mL，加蒸馏水 至4000毫升，根据初算结果用2mol/L的盐酸和蒸馏水调节酸度至2mol/L和浓度为10%。 0.05% (g/mL)三氯化铁溶液 量取10%三氯化铁溶液5mL，2mol/L盐酸5mL，加蒸馏水至1000mL，摇匀 9mol/L盐酸溶液 量取蒸馏水500mL于2000mL试剂瓶中，加浓盐酸1500mL，摇匀 2mol/L盐酸溶液 0.01mol/L盐酸溶液 量取浓盐酸16.7mL加蒸馏水至100mL，摇匀 量取2mol/L的盐酸5mL加蒸馏水至1000mL，摇匀 1000u/mg土霉素标准液 在分析天平上称取已知u/mL（生物效价）土霉素标准品W克，加1mol/L盐酸4mL，溶解完全后（约5min），加蒸馏水至200mL，放冰箱备用
实验七 中性蛋白酶产生菌株的筛选
一、实验目的要求：
掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基的制备，灭菌等无菌操作技术，棉塞等过滤介质的制作。
二、实验原理
中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。比值大的其产酶活力明显增大。
三、材料与方法 1.1材料 1.1.1试验材料
供试材料为土壤样品。采自本校二食堂附近。 1.1.2培养基
（1）干酪素培养基：干酪素2.0％（用适量NaOH溶液加热溶解），琼脂1.5％，pH7.0（或干酪素 4g，硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，硫酸铁 0.01g，蔗糖 30g，琼脂20g， 1000mL）。
（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.4％，蛋白胨0.6％，酵母浸出粉0.2％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，pH7.0
（3）发酵培养基Ⅰ：麸皮4.0％，蛋白胨0.1％，Na2HPO4·12H2O 0.4％，KH2PO4 0.03%，pH7.0。
发酵培养基Ⅱ：可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.5％，Na2HPO4·12H2O 0.4%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH7.0。 1.2主要仪器与设备
超净工作台，恒温培养箱，恒温振荡培养箱，恒温水浴锅，台式低速离心机，721型分光光度计 1.3方法步骤
1.3.1菌种的分离纯化与筛选
初筛：从土壤中采集样品，通过常规稀释平板法，即取10 g土壤样品置于已加入90mL无菌水的三角瓶中，220 r／min旋转摇床，20 min后取出，静置30 s。此三角瓶中液体的浓度为10-1，再用7支分别装有9 mL无菌水的试管进行稀释，稀释至10-8。
将干酪素培养基分别倒入已灭菌的6个平皿中，每个平皿倒入10 mL左右，然后吸取0.1 mL的10-6，10-7，10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面，每个稀释浓度涂布2个平皿。37 ℃培养24 h。肉眼选出产生透明圈的菌株。
将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿（每个平皿倒10mL左右，置平板）和7支试管（每支试管6mL左右，置斜面）内。然后将选出来的若干株菌在平皿上划线，每株划一个平皿。37 ℃培养24 h。取出，然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管（每个平皿对应一支斜面试管）进行活化培养，37 ℃培养24 h。
复筛：从斜面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基Ⅰ的三角瓶中进行发酵培养。30 ℃恒温振荡培养48 h，3500r／min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。用发酵培养基Ⅱ进行发酵培养，30 ℃恒温振荡培养48 h，3500 r／min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力最高的1株。 2. 中性蛋白酶活力的测定 2.1原理
采用福林-酚试剂法。福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度计在660 nm处测定，从而计算出蛋白酶活力。 2.2试剂
2.2.1福林-酚试剂