复旦大学
硕士学位论文
人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
姓名：王秀华
申请学位级别：硕士
专业：儿科学/心胸外科
指导教师：贾兵
20070420
论文独创性声明
本论文是我？＋入在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论支中滁了蒋裁热强标注兽爨致落麓缝方羚。不瓴含英缝久或其它梳猕已翌发表或撰篝适的研究成果。其池同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的鸯明并表示了谢意。
俸誊麓名：至整聋．量期：２２：点：！主
论文使用授权声明
本人完全了瓣复量大学有关漂辫、蓬震学霞论文的缓定，霹：掌校有权景譬送交论文的夏印件，允许绝文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部势内容，可以采用影；ｎ、缩印或其它复制手段保存沦文。保密的论文在解密后遵守此疑定；
矗＼
导师蕊名怍者签名：ｊ丧笪‘－。。。。一‘。。。。＿。。。＿。。。。＿。●＿＿一京日期：ｏ７．１、－ｊ§
人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
中文摘要
目的：
诱导脐血来源内皮祖细胞分化为内皮细胞，探索分离、培养以及鉴定脐血来
源的内皮祖细胞方法，探讨其用作组织工程心血管修复物种子细胞来源的可行
性。
材料和方法：
新鲜脐血１５份，采用６％羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合应用分离
脐血单个核细胞。根据所用的细胞培养液的不同，将实验分两组：诱导组和未诱
导组。诱导组是在含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ加ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ等多种生长因子的条
件培养液中培养；未诱导组是在含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ不加生长因子的基本培养
液中培养。从以下几个方面对脐血来源内皮祖细胞进行鉴定：在倒置相差显微镜
下进行贴壁细胞形态学观察，电镜下观察细胞特征性的超微结构，免疫荧光显微
镜和流式细胞仪检测内皮细胞特征性表面标志ｖＷＦ、ＶＥＧＦＲ－２和ＣＤｉ３３，测定
细胞培养液中一氧化氮（ＮＯ）含量分析细胞的功能，观察细胞的增殖能力等。
结果：
从新鲜脐血中得到的单个核细胞数平均为（３．４＋２．１）Ｘ１０７／ｍＬ。诱导组
贴壁细胞培养分化过程中细胞形态发生了改变，从小圆形变成梭形，形成集落样
生长，２周左右分化成典型成熟内皮细胞的铺路石样形态。而未诱导组细胞集落
少，未见铺路石样形态细胞。７天后免疫荧光检测发现诱导组细胞明显表达内皮
细胞特异性标志ｖＷＦ和ＶＥＧＦＲ－２，偶有ＣＤｌ３３表达。而未诱导组无此明显阳
性反应。流式细胞仪分析诱导组单个核细胞经诱导分化后细胞表面表达ＣＤｍ下
降，从（３．１１±１．０５）％下降至（Ｏ．０９＿＋０．０２）％，Ｐ＜０．０５。透射电镜观察到诱导组
培养１４天的细胞胞浆中已出现典型的内皮细胞超微结构，即Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体。
培养１４天培养液中ＮＯ含量测定的结果显示：未诱导组、诱导组和人成熟脐静
脉内皮细胞培养液中ＮＯ含量分别为（１２．４３±４．５１）ｕｍｏｌ／Ｌ、（５２．０７±２．１７）ｕｍｏｌ／Ｌ
和（８３．６５±６．１４）ｕｍｏｌ／Ｌ，３组数据间两两比较Ｐ值均＜ｏ．０５。诱导组培养液中ＮＯ
含量显著高于未诱导组，但低于成熟内皮细胞，细胞已具备部分成熟内皮细胞的
功能。诱导组细胞较未诱导组细胞增殖快，细胞原代培养２周左右，细胞数量即可达到１０５左右。
人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
结论：
１．采用６％羟乙基淀粉（ＨＥＳ）沉降法和Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ分层法联合应用从脐血中
分离出的单个核细胞中存在内皮祖细胞。
２．利用含ＶＥＧＦ等细胞因子的条件培养液可以将内皮祖细胞在体外诱导分化为
内皮细胞。
３．采用综合方法从细胞形态、特殊表面标志、细胞超微结构、产生ＮＯ的功能
以及增殖能力等方面可以鉴定内皮祖细胞。
４．脐血来源内皮祖细胞具有较强的分化增殖能力，细胞总数可达到１０８以上，能
够满足血管组织工程对种子细胞数量的要求，部分具备内皮细胞的功能，提示分
化的内皮细胞可能具有用作构建组织工程心血管修复物种子细胞的可行性。
关键词：
脐血内皮祖细胞内皮细胞组织工程
中图分类号：Ｒ７２（９）２
人脐血来源内皮租细胞的分离，培养及鉴定
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｏｆｈｕｍａｎｃｏｒｄｂｌｏｏｄ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ＂
Ｔｏｉｎｄｕｃｅｃｏｒｄｂｌｏｏｄｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ（ＥＰＣｓ）ｉｎｔｏ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇ，ｃｕｌｔｕｒｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｌｙｉｎｇＥＰＣｓ
ｏｆｈｕｍａｎｃｏｒｄｂｌｏｏｄａｎｄｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｓｔｈｅｓｅｅｄｃｅｌｌｓｏｆｔｉｓｓｕｅ
ｅｎ西ｎｅｅｒｉｎｇｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．
ＭａｔｅｒｉａｌａｎｄＭｅｔｈｏｄ：
ｃｏｒｄｂｌｏｏｄｗｅＴ｜ｅｕｓｅｄ．ＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＦｉｆｔｅｅｎｈｕｍａｎ
ｆｒｅｓｈｃｅｌｌｓⅥ恤ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｏｒｄｂｌｏｏｄｂｙ６％ＨＥＳａｎｄｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｏｇａｔｉｏｎ。Ｔ１１ｉｓｓｔｕｄｙｗａｓ
ｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔＯｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｕｍ：ｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｕｎｉｎｄｕｃｅｄ
ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ．ｃｅｌｌｓ
ＳＯｏｎｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｉｎｕｎｉｎｄｕｃｅｄＩ∞ＡＦＢＳＤＭＥＭｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＶＥＧＥｂＦＧＦａｎｄａｎｄｇｒｏｕｐ，ｃｏｉｌｓＩＯ％ＦＢＳ