血管生成出现的血岛（ｂｌｏｏｄｉｓｌａｎｄ）Ｉｌｌ，中央为圆形细胞，周围为“翁锤样”梭
形细胞，分化出的梭形细胞袭现出较高的增殖能力，向外放射状扩散，并可见梭
形维照蓠藩连接，猱强戒线获（图３），条索旋缀构，有嚣逐可冤到耨簿缓藏警
行排列璺管样结构（图４），随膊可见大部分细胞都伸展开来，细胞体积明显增大，
多数为梭形或多角形，缨胞连接蓑融合娥片状生长。２ｗ左农缨照呈镶鼹石样（强
５），几乎铺满培养瓶底。传代培养后，细胞２４ｈ内贴壁，量梭形，１ｗ即可传代。
藩莰未诱导缀续戆薅壁辩阗霜诱导缓，整绥藏褰落乡，泰觅典墼戆线撵攥列。
未诱导缎细胞传代厝，细胞逐渐变为成纤维细胞样，未见铺路石样形态细胞。
图１剐分离的单个核细胞星小而圆形（Ｘ
１００）
△墅些墨塑堕堕塑塑些塑坌塑：苎茭墨垄塞
图２培养７ｄ时细胞成簇状生长（Ｘ１００）
图３梭形细胞首尾连接，排列成线状（×２００）
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人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
图４两排细胞平行排列呈管样结构（×２００）
图５培养１４ｄ左右细胞呈铺路石样（×２００）
＾脐皿来源内皮祝细胞的分礴、培养及鉴窀
三。纲藏缵藿襞秀
诱导组细胞较米诱导组细胞增殖快，在培养的第５－７ｄ原代贴壁细胞增殖活
性最强，形成大量的细胞集藩，细胞原代培养２ｗ左右，细胞数量即可达到１０ｓ
左右。藤代细胞生长相对予传代后馒～整，麴２ｗ可传代，传筏后刘纲胞增殖较
快，１ｗ旋右即需传代。细胞传代４８ｈ厝细胞增殖活力恢复，进入快速增殖期。
四．免瘦荧光观察
１．荧光照徽镜下贴壁细胞胞浆检测ｖＷＦ：细胞浆内表达ｖＷＦ是内皮细胞的特
异性蠡恚。培养ｄ７诱导缰缡缒ｖＷＦ黧鞠显鬻程染色（踅６），两未诱导缰无魏
明显阳饿反应。
２．荧光湿微镜下贻壁细胞臌浆检测ＶＥＧＦＲ－２：缩养ｄ７诱导组细胞黧阳性染色
（图７），而未诱导组无此阳性反应。
３．荧光鼹微镜下贴壁细胞胞浆检测ＣＤｌ３３：偶见阳性表达（图８）。
圈６壤葬静缨簸豹Ｖ强，ｒＦ受痰荧光染色麓瞧（ｘ２００）
１４
一——一．一△墅些塞堡空堕望塑堕堕坌查：些鲞墨些塞
图７培养ｄ７细胞ＶＥＧＦＲ－２免疫荧光染色阳性（Ｘ２００）
图８培养ｄ７细胞ＣＤｍ免疫荧光染色偶见阳性（Ｘ２００）
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人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
五．流式细胞仪分析刚分离出的单个核细胞中ＣＤｌ３３＋细胞占（３．１１±１．０５）％，诱
导分化培养ｄ７，贴壁细胞中ＣＤｌ３３＋细胞减少至（ｏ．０９－－＋０．０２）％，Ｐ＜０．０５，ｎ＝６。
六．透射电镜观察原代培养ｄ１４细胞透射电镜观察显示，胞浆中出现一种短棒
状小体，含平行管状的内部结构，即Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体，是成熟血管内皮细胞
的特征性超微结构。此外，细胞内还可见到较多线粒体、内质网和溶酶体等细胞
器，提示细胞代谢旺盛（图９，１０）。
图９，１０培养ｄ１４的细胞电镜照片，细胞胞浆中可见Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体（ＴＥＭＸ２００００）
七．内皮细胞ＮＯ分泌功能测定
细胞培养液中ＮＯ含量测定结果如下：未诱导组、诱导组和人成熟脐静脉内
皮细胞组培养液中ＮＯ含量分别为（１２．４３±４．５１）ｕｍｏｌ／Ｌ、（５２．０７＋２．１７）ｕｍｏｌ／Ｌ和
（８３．６５＋６．１４）ｕｍｏｌ／Ｌ，３组数据问两两比较Ｐ值均＜０．０５（图１１）。
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人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
４０
３０
２０
１０
对照组诱导组哪ＶＥｃ组
图１１培养ｄ１４细胞培养液中ＮＯ含量测定
讨论
１ＥＰＣｓ的分离方法
由于ＥＰＣｓ的研究仍处于早期阶段，缺乏特有的表面标志，因而目前分离
ＥＰＣｓ有一定的难度。大量胚胎学研究结果表明，造血系统祖细胞与血管内皮祖
细胞来源于共同的干细胞一血液血管干细胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ），因而它们具有多种
相同的抗原表达，包括ＣＤ３４、Ｆｌｋ—ｌ、Ｔｉｅ－２、ＶＥＧＦＲ一２等。故至今仍未发现能
同时将ＥＰＣｓ与造血细胞及成熟血管内皮细胞完全区分开的特异细胞表面标志。
ＣＤ３４曾被认为是最重要的造血干细胞的标志物。进一步研究表明，ＣＤ３４不仅
表达在ＨＳＣｓ上，也在成熟的内皮细胞上有低水平的表达。故研究转向代表更早
期的造血干细胞表面标志ＣＤｌ３３。ＣＤｌ３３是新近发现的造血干细胞早期标志，
是分子量为１２０ＫＵ的糖基化多肽，含有５个跨膜结构，是一种早期抗原，它选
择性的在骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表达１４Ｊ，但在成熟内皮细胞上不
表达。研究表明，纯化的ＣＤｌ３３＋细胞在体外能分化为内皮细胞。在分化过程中，
ＥＰＣｓ明显失去ＣＤｌ３３，并开始表达成熟内皮细胞特有的表面标志，如ＣＤ３１、血
管内皮钙粘着素和ｖＷＦ。因此，ＣＤ３４＋／ＣＤｌ３３＋细胞可能是循环中最原始的祖细
胞群，而ＣＤ３４＋／ＶＥＧＦＲ－２＋可能代表血管壁脱落的成熟内皮细胞。目前认为，表
达ＣＤ３４，ＶＥＧＦＲ－２及ＣＤｌ３３的细胞为ＥＰＣ矿Ｊ。１７