均匀后调节ＰＨ值，无菌过滤后分装，每瓶加入ＦＢＳ，制成含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ
细胞培养液。
４．条件培养液：在１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液中加入
ＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ，ＩＧＦ一１２ｎｇ／ｍＬ，ｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍＬ，ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ。
二．方法
ｌ实验分组
根据培养细胞所用培养液不同，本实验分为两组：
１．诱导组：采用加有ＶＥＧＦ等生长因子的条件培养液培养细胞。
２．未诱导组：采用含１００６ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液培养细胞。
２脐血中单个核细胞的分离
采用６％羟乙基淀粉（ＨＥＳ）沉降法和Ｆｉｅｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ分层法联合应用。
１．在无菌条件下，取足月健康分娩新生儿的脐血。用含５０ｍｌ细胞保存液的血袋
收集，抗凝剂为Ｏ．６％复方枸橼酸钠血液保存液，ＡＣＤ．Ａ，在８ｈ内处理完。
２．按ｌ：４比例将６％ＨＥＳ和新鲜脐血混合，４＂Ｃ静置６０ｍｉｎ．
３．收集上层富含白细胞的血浆层，４＂１２，１５００ｆ／ｒａｉｎ离心１５ｍｉｎ。８
４．弃上清，重悬细胞于ＰＢＳ缓冲液中，按２：１比例将细胞悬液轻轻平铺于
Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ表面，４℃，２０００ｒ／ｒａｉｎ，密度梯度离心３０ｍｉｎ。
５．离心后，可见离心管中液体分成三层，上层为血浆和ＰＢＳ液，下层主要为红细
胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的
白膜层，小心吸取中间白色膜状层单个核细胞。ＰＢＳ洗涤两次，离心弃上清。
６．收获的单个核细胞分别于ＤＭＥＭ基本培养液和ＤＭＥＭ条件培养液中分组培
养。
３原代诱导分化培养及传代
１．原代培养
人纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）用ＰＢＳ稀释成２０ｎｇ／ｕＬ后，包被７５ｅｒａ２
培养瓶，置于３ＴＣ培养箱中孵育３０ｍｉｎ后，轻轻吸去表面多余液体。分别用低
糖ＤＭＥＭ条件培养液和ＤＭＥＭ基本培养液重悬分离好的单个核细胞，调整细
胞浓度为５×１０６／ｍＬ，接种于包被好人纤维连接蛋白的７５ｃｍ２培养瓶中，置于
饱和湿度，５％Ｃ０２的培养箱中培养，４ｄ后首次以双倍浓度细胞因子培养基半量
换液，以后每过３ｄ半量换液，倒置相差显微镜下观察贴壁细胞的形态变化和增
殖情况。
２．传代培养
当原代细胞诱导培养后，细胞铺满培养瓶８０－－８５％时，以Ｏ．２５％胰蛋白酶
－０．０１％ＥＤＴＡ混合液进行室温消化，显微镜下控制时间，待贴壁细胞收缩为圆形，
细胞间隙增加，细胞间连接松散后，弃消化液，加入含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ中止消化，
轻轻吹打细胞，镜下观察绝大多数贴壁细胞悬浮于培养液后，洗涤后计数，以１：
２￣３比例接种进行传代。传代培养后每３ｄ换一次液，倒置相差显微镜下观察细
胞的形态变化和增殖情况。
４内皮祖细胞的观察和鉴定
１．形态学观察：每天在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。
２．表面标志鉴定：应用免疫荧光法、流式细胞仪检测细胞表面ＣＤｍ、ＶＥＧＦＲ－２
和ｖＷＦ的表达。
（１）免疫荧光法：检测培养７ｄ贴壁细胞ＶＥＧＦＲ－２和ｖ、ＶＦ抗原的表达。
１）细胞经４％多聚甲醛固定２０ｍｉｎ、１％Ｔｒｉｔｏｎ打孔２０ｒａｉｎ，，以增加细胞膜的通９
透性，加入含Ｏ．５％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭４０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次。
２）加入兔抗人ＶＥＧＦＲ－２和ｖＷＦ的单克隆抗体，阴性对照组只加ＰＢＳ，３７＂Ｃ孵
育６０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次。
３）加入ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔二抗，３ＴＣ孵育６０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎｘ３次，，荧
光显微镜下观察，亮绿色荧光细胞为阳性细胞。以不加一抗的培养细胞作空白对
照
（２）流式细胞仪分析：检测新鲜分离和培养７ｄ后细胞中ＣＤｍ阳性细胞。
１）培养７ｄ后的细胞用胰酶消化下来，ＰＢＳ洗涤。
２）约１×１０６个细胞沉淀中加入１００ｕＬ含０．５％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭。
３）加入１０ｕＬＰＥ－ＣＤｌ３３，混匀．使ＣＤｌ３３稀释成１：ｌｌ，４＂Ｃ避光孵育１０ｍｉｎ。
４）ＰＢＳ洗涤并重悬后，进行流式细胞仪ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂ．Ｄ）分析，计数１０５细胞，
ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析结果，同时以ＰＢＳ替代ＣＤｌ３３单抗作阴性对照。对照组用
鼠抗人同型ｌｇＧｌ型作对照。ＣＤｌ３３阳性细胞百分率通过矫正同型对照的百分率
计算。
３．透电镜观察将诱导组培养１４ｄ的细胞送上海医学院电镜室处理后，观察培养
１４ｄ时细胞的超微结构。
４．内皮细胞分泌ＮＯ功能检测：测定细胞培养液一氧化氮（Ｎｏ）含量。实验分
三组：诱导组、未诱导组、人成熟脐静脉内皮细胞组。将上述三组培养１４ｄ生长
状态良好的细胞，以１×１０９，／Ｌ的密度接种于六孔培养板内，每组６孔，另设空
白对照组，培养２４ｈ后收集各孔内培养液检测。检测使用ＮＯ检测试剂盒，购自
南京建成生物工程研究所，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，以分光光度计测
定。其原理是采用硝酸还原酶法特异性将培养液中ＮＯｒ还原为Ｎ０２＂，并测定Ｎ０２’
浓度，从而间接反应ＮＯ含量。
５统计学处理
结果以均数±标准差（一Ｘ±ｓ）表示，，Ｉ习ＳＰＳＳｉ０．Ｏ软件作统计学处理，ｐ＜０．０５
为有显著性差异，有统计学意义，组间比较应用ｔ检验。１０
人脐血来源内皮袒细胞韵分离、培养及鉴定
结果
一．脐呶单个核细胞的分离从新鲜脐舰中（每份４０～１００ｍＬ，ｎ＝１５）得到的
擎令孩绥戆数平均隽（３Ａ＋２。１）Ｘ１０７／ｍＬ。
二。形态学观察剐分离出来的单个核细胞呈小丽圆形（圈１），诱嚣组细胞撼
养２４ｈ麓在开始辩髓，髓瑶，细戆基零雅壁生长，细魏逐渐变大并＿ｌ窥长，高倍镜
下，部分细胞可见分裂相，并大量增殖，但多数细胞仍为小圆形，７ｄ左右，可
见鲴戆戏嶷落撑生长，形成多个细胞簇（图２）。缍藏蔟鹃缝魏类戳予坯黪霹期