刚舌
我国先天性心脏病的发病率为７‰，每年估计新发病例近２０万。目前我国
先天性心脏病的外科治疗病例中约４５％需要应用修复材料。目前Ｉ临床常用的血管
修复材料主要有两类，即天然血管和人工血管。天然血管包括自体血管和同种异
体血管，其缺点是来源极其有限，对机体造成了新的创伤。人工血管如聚四氟乙
烯，其缺点是因缺乏内膜，易形成血栓；顺应性差，缝合处易撕裂；缺乏生长能
力，需再次手术；再狭窄率２０－３０％，５年通畅率＜２０％。故目前临床上仍然缺乏
理想的血管替代物。
组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织
或器官的新兴学科。１９８７年由美国研究者首先开始该领域的研究。组织工程构
建的三要素是种子细胞、生物材料和组织构建，其中种子细胞是关键和前提。
组织工程心血管修复材料早期研究的种子细胞主要从机体自身动脉或静脉
获得内皮细胞，细胞来源有限，而且对供体具有创伤性，在小儿尤其新生儿心血
管病例更为困难。更重要的是，来源于成熟血管的内皮细胞多为终末分化细胞，
易老化，扩增数量有限，不能满足血管构建对大量种子细胞的要求。因此寻找初
期分化细胞来源的内皮种子细胞已成为血管组织构建的关键。
干细胞技术的成熟加速了心血管组织工程的发展。内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＥＰＣｓ）是血管内皮细胞的前体细胞，有分化为血管内皮细胞的能
力，又称血管母细胞（ａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）或血管内皮干细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ），１９９７
年由Ａｓａｈａｒａ！ｌＪ等首次从成人外周血分离，在生后机体的血管新生中起重要作用。
近来大量研究表明骨髓、脐血、外周血、胚胎组织、脂肪组织等中富含内皮祖细
胞，骨髓和脐血中此种细胞的含量和增殖能力远高于外周血１２】，在ＶＥＧＦ或缺血
刺激下可以增生、分化为内皮细胞，它在体内具有明显的内皮修复以及促血管新
生作用口１，这提示ＥＰＣｓ有可能作为组织工程血管的种子细胞来源。
胚胎组织的获取和实验存在很多伦理方面的争论，循环血液中ＥＰＣｓ数量稀
少，采集足够数量的ＥＰＣｓ技术上比较困难，脂肪组织中ＥＰＣｓ获取需要手术采集大量脂肪组织，损伤较大。骨髓的获取具有侵入性。因此我们选取了脐血作为
人脐血来源内皮祖细胞的分离，培养及鉴定
ＥＰＣｓ的来源。探索由脐血来源内皮祖细胞分化的内皮细胞作为组织工程血管的
种子细胞来源的可行性和必要性在于：随着先天性心脏病产前诊断的开展和脐血
库的逐步建立，对于婴幼儿先天性心脏病病例，可应用自体脐血来源内皮祖细胞
分化的内皮细胞，经体外培养扩增后，作为组织工程血管的种子细胞，构建组织
工程心血管修复材料，此方法对患儿无创伤，而且也不存在免疫排斥问题，所以
是潜在的非常理想的种子细胞来源。
本实验研究的目的在于从脐血中分离出单个核细胞，建立体外培养、诱导分
化以及鉴定ＥＰＣｓ的方法，以探讨由脐血来源内皮祖细胞分化的内皮细胞用作组
织工程血管的种子细胞来源的可行性及其理论基础。６
人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
材料和方法
一．材料
ｌ材料、试剂和仪器
新鲜脐血：上海国际和平妇幼保健院提供。
细胞分离液Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ（１．０７７９／ｍ１）．．Ｓｉｇｍａ公司，美国。
羟乙基淀粉（ＨＥＳ）：Ｓｉｇｍａ公司，美国。
人血清纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司，美国。
ＤＭＥＭ培养基（干粉）：Ｓｉｇｍａ公司，美国。
胎牛血清（ＦＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ公司，美国。
血管内皮生长因子ＶＥＧＦ：Ｂｉｏｓｏｕｔｒ．ｅ公司，美国。
胰岛素样生长因子ＩＧＦ．１：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ公司，美国。
碱性成纤维细胞生长因子ｂＦ（３Ｆ：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ公司，美国。
表皮生长因子ＥＧＦ：Ｃｙｔｏｌａｂ公司，美国。
胰蛋白酶：Ｓｉｇｍａ公司，美国。
ＥＤＴＡ：Ｓｉｇｎｍ公司，美国。
ＰＢＳ溶液：上海医药化学试剂厂。
ＣＤｌ３３抗体：ＭＡＣＳ公司，德国。
Ｆｌｋ－ｌ抗体：ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司，美国。
ｖＷＦ抗体：ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司，美国。
ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ：ｖｅｃｔｏｒ公司，美国。
ＮＯ检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。
超净台：上海汇龙仪表电子有限公司环境工程装配分公司。
水平离心机：ＥＰＰＥＮＤＯＲ＿Ｆ公司，美国。
恒温磁力搅拌器：ＩｋａｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉＬ德国。
３７℃、５％Ｃｔｈ高湿度恒温孵育箱：ＴｈｅｒｍｏＣｏ，美国。
电热恒温水浴箱：上海医疗器械七厂。
倒置相差显微镜：Ｎｉｋｏｎ，日本。
数码照相机：Ｎｉｋｏｎ，日本。７
荧光倒置显微镜：Ｎｉｋｏｎ，日本。
６孔，２４孔，９６孔细胞培养板：ＪｕｎＣｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ。
微量可调移液器：ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ公司，美国。
透射电镜（ＴＥＭ）：日立，日本。
流式细胞仪：ＢＤ，美国。
２主要培养液及试剂的配制
１．消化液（Ｏ．２５％胰蛋白酶．０．０１％ＥＤＴＡ混合液）：称取２９胰酶，加入ＰＢＳ２００ｍｌ
溶解，过滤除菌，即配成１％的胰酶，再称取ＥＤＴＡ２００ｍｇ。加入ＰＢＳ２００ｍｌ溶解，
过滤除菌，即配成Ｏ．Ｉ％ＥＤＴＡ，使用时取１％的胰酶２．５ｍｌ和０．Ｉ％ＥＤＴＡＩｍｌ。用ＰＢＳ
稀释成１０ｍｌ，即配制成Ｏ．２５％胰蛋白酶一０．０１％ＥＤＴＡ混合液。
２．６％ＨＥＳ：称取６９羟乙基淀粉，用１００ｍｉ０．９％ＮａＣＩ溶液溶解，用磁力搅拌器搅
拌至颗粒消失，再高压灭菌。
３．１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液：在１０００ｍｌ去离子水中加入ＤＭＥＭ干
粉ｌＯｇ，ＮａＨＣ０３３．３９，青霉素Ｏ．０６２９，链霉素Ｏ．１９，谷氨酰胺０．３９，Ｈｅｐｅｓ３．７５９，搅拌