λ噬菌体载体 柯斯质粒载体 M13载体 <23kb <45kb 300~400bp 构建基因文库和cDNA文库 构建基因文库 制备单链DNA；定位诱变；噬菌体展示 六、真核生物的克隆载体
以上主要讨论了原核生物的克隆载体。但是关于真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，是原核生物载体所无法解决问题。因此为了适应真核生物基因工程的需要，现已构建了一系列真核生物载体，主要有以下几大类：
1.酵母质粒载体
酵母质粒载体都是利用其2?m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有以下三种(图10-5)：
图10-5 酵母质粒载体 （1）附加体质粒（episomal plasmid）
该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素
r
抗性基因（Amp）。此外还有来自酵母2m m质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
（2）复制质粒（replicating plasmid）
该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因rr
（Amp）和四环素抗性基因（Tet）。还有来自酵母染色体的自主复制序列（ARS），以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1），故这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。
（3）整合质粒（integrating plasmid）
该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性
rr
基因（Amp）、四环素抗性基因（Tet）。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
2.真核生物病毒载体 （1）哺乳动物病毒载体
这类病毒载体具有许多突出优点：例如动物病毒能够有效识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中，以及高拷贝和强启动子等，有利于真核外源基因的克隆与表达。目前利用许多哺乳动物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。
（2）昆虫病毒载体
昆虫中的杆状病毒的衍生物作为载体具有许多优点，主要为高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达100kb；其次具有高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25％左右，甚至更多；此外，它具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和哺乳动物疾病。
（3）植物病毒载体
一些RNA病毒和DNA病毒已被改造为植物基因工程载体。目前植物基因工程操作较多使用双链DNA病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。
6
七、 人工染色体
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。它是由默里（Murray）于1983年首次构建成功的。伯克（Burke）等于1987年用以构建成YAC克隆库。
酵母染色体的控制系统主要包括三部分： ①着丝粒（centromere, CEN）它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞。
②端粒（telomere, TEL）位于染色体两个末端，它的功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失。
③酵母自主复制序列（autonomously replicating sequence, ARS），其功能与酵母细胞复制有关。
酵母人工染色体（图10–7）除有端粒、着丝粒、自主复制序列等外，还有选择标记基因（如TRP1和URA3等）。
图10-7 酵母人工染色体（YAC）
YAC克隆外源DNA能力非常大，一个YAC可插入长达100万碱基以上DNA片段。因此YAC既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。目前YAC已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。
除酵母人工染色体外，现已构建细菌人工染色体（BAC）更便于基因工程操作，在人类基因组研究中正被广泛应用。
第三节 微生物与基因工程工具酶
基因工程操作需要用到一些基本的工具酶。例如在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需在DNA连接酶的催化下，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。此外，重组DNA技术还需要一些其他的工具酶。值得注意的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）或简称为限制性酶（restrition enzyme）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。
1.限制性内切酶的命名与分类
限制性酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。例如EcoRI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出来的酶。如限制酶是来自同一属的细菌，而且种名的头两个字母完全相同，这时其中一个菌的酶命名的第三个字母可用种名的词头后的另一个字母代替。例如副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）的酶表示为HpaI 和HpaII；而副溶血嗜血杆菌（Haemophilus parahaemolyticus）的酶表示为HphI。
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型，I型和III型由于无切割特异性或特异性不强故不用于基因工程，II型限制酶的限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶
2+
两种不同的酶组成，仅需Mg作为辅助因子，切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强，用处最大，是基因工程重要工具酶，通常所说的限制性核酸内切酶，即指此类酶。
7
2.限制性核酸内切酶的基本特性
II型限制酶的识别序列通常由4～8个碱基对组成，他们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的
，，
序列呈回文结构（palindromic structure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：
(1) 形成粘性末端（cohesive end）
有些限制酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成的DNA限制片段具有粘性末
，
端。例如HindIII切割结果形成5单链突出的粘性末端；而PstI切割结果却形成3￠ 单链突出的粘性末端。
（2）形成平末端（blunt end）
有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如HpaI切割结果形成平末端。
HindIII的识别序列是： HpaI的识别序列是：
不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。
同裂酶（Isoschizomers） 有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等方面可能有所差别）。
同尾酶(Isocaudomers) 有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI 和MunI属于同尾酶。
MunI的识别序列是： EcoRI的识别序列和切割位点：
表10-2介绍一些常用限制酶的识别序列及其产生菌。
表10-2 若干常用限制酶的识别序列及其产生菌 限制酶名称 识别序列 G↓GATCC G↓AATTC A↓AGCTT GGTAC↓C CTGCA↓G CCC↓GGG T↓CTAGA G↓TCGAC GCATG↓C 产生菌 淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliuifaciens H） 大肠杆菌（Eschericha coli Rr13） 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae Rd） 肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae OK8） 普罗威登斯菌属（Providencia stuartii 164） 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens sb） 黄单胞菌属（Xanthomonas badrii） 白色链霉菌（Streptomyces albus G） 暗色产色链霉菌（Streptomyces phaeochromogenes） 8
BamH I EcoR I Hind III Kpn I Pst I Sma I Xba I Sal I Sph I
Nco I C↓CATGG 珊瑚色诺卡代菌（Nocardia corallina） 二、DNA连接酶（DNA ligase）
DNA连接酶与限制性内切酶一样，也是由微生物产生。主要来自T4噬菌体和大肠杆菌，也是重组DNA技术中具有头等重要的工具酶，重组DNA技术核心步骤是在体外利用DNA连接酶将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子。目前常用的三种体外DNA连接方法为： 用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段； 用T4 DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段； 先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再行连接。
,,
DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。DNA连接酶主要有两种：一种是T4 DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。T4 DNA连接酶由一条多肽链组成，分子量为
2+
6800，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。大肠杆菌DNA连接酶的分子量
＋
为7500，连接反应的能量来源是NAD，此酶催化DNA连接反应与T4 DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。
除上述二种工具酶以外，还有其它重要的工具酶也是来自微生物，如DNA聚合酶I（DNA ploymerase I）、Klenow聚合酶，以及逆转录酶（reverse transcriptase）等。
第四节 微生物作为克隆载体的宿主
为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，选择合适的克隆载体宿主就成为基因工程重要问题之一。
一、宿主的基本要求与性质
对于克隆基因而讲，一个理想宿主的基本要求是： ①能够高效吸收外源DNA；
②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；
③不具有限制修饰系统（hsd system），故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；
-④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；
⑤便于进行基因操作和筛选；
⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。
某些工程微生物，如原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有一些突出优点如生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚等，因此他们已成为当前基因工程被广泛应用的重要克隆载体宿主。
二、原核生物宿主
在选择原核微生物作为克隆载体宿主时，还应考虑下列一些问题：首先应根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞。例如当选择质粒DNA作为载体并通过转化方式进入细胞，最好选择易于形成感受态细胞的细菌作为宿主，以利于宿主细胞有效吸收外源DNA；又如若选择经体外包装的l 噬菌体载体或柯斯质粒作为克隆载体，并以感染方式进入细胞，则应选择l 的敏感宿主(E.coli k12菌株)作为克隆载体宿主；当用M13衍生物作为克隆载体，则应选择含有F因子的雄性大肠杆菌作为宿主。其次为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体基因相对应。例如若载体携带氨苄青霉素抗性基因，则相应宿主应该是对氨苄青霉素敏感细菌；若载体携带β-半乳糖苷酶α-肽的编码序列，那么应选择该基因N端部分编码序列缺失的突变株(Lac Z△M15)作为宿主；最后为了安全目的，需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。例如构建的载体中某一重要基因编码序列发生琥珀突变，这时必需选择具有强琥珀突变抑制基因的宿主，重组载体离开该宿主即无法存在。
9
目前几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主，但是存在一些不利之处。首先由于它是条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。再有，外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确加工折叠。目前上述多数问题已有办法加以解决。
其他细菌，如枯草芽孢杆菌，也已发展成为克隆载体的宿主。它不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。但是枯草芽孢杆菌作为克隆载体也存在不足之处是，它的质粒往往不稳定，经多次传代后，很难保持质粒继续复制，外源DNA不能很好保留在细胞内甚至发生突然丢失。因此，使枯草芽孢杆菌作为克隆宿主的应用受到一定的限制。
三、真核生物宿主
利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。第一它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；第二它有利于真核基因产物的翻译后加工。
酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。这是由于对其遗传学有较深入的了解；其基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等真核生物；此外它具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行大量宿主安全试验。目前已构建了一系列酵母质粒载体及酵母人工染色体。通过转化，可将大片段的外源DNA导入酵母细胞，并得到正确的克隆和表达。它对于高等真核生物基因组及其转录、翻译系统研究提供了一个良好基础。
利用哺乳动物细胞进行基因克隆极为重要，有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多研究均赖以进行。但是哺乳动物细胞作为宿主不利之处是，若要进行大规模细胞培养，则费用过于昂贵和难于操作，同时克隆基因的表达水平也常常是极低的。现在已开发昆虫细胞系作为一种昆虫DNA病毒（杆状病毒）载体的克隆宿主，较易进行大规模的细胞培养。
四、外源DNA导入宿主细胞
将外源DNA导入宿主细胞是分子克隆关键步骤之一。其导入方式是多种多样的：
1. 外源DNA导入原核细胞 外源DNA可通过转化、转染以及感染等方式被导入原核细胞 (1) 转化或感染
如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入宿主细胞。无论转化或转染都需用氯化钙处理宿主细胞,使细胞变得易于吸收外源DNA，这种细胞称为感受态细胞。大肠杆菌转化程序：一般先用一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理对数期的大肠杆菌细胞，然后加入外源DNA并短暂给予42℃热
78
休克处理约90s，使感受态细胞有效吸收外源DNA。一般转化效率可达到每微克DNA转化10~10个细胞。
(2) λ噬菌体的体外包装与感染
如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。λ噬菌体DNA体外包装技术是贝克勒(Beckler)和戈尔德(Gold)于1975年最先建立的。体外包装是将重组DNA分子与λ的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的λ噬菌体粒子。
9
体外包装的λ噬菌体用以感染宿主细胞，每微克DNA可产生10的噬菌斑。而如果仅用重组λ
45
DNA分子通过转染进入大肠杆菌的感受态细胞。则每微克DNA仅能产生10~10的噬菌斑，说明感染
45
效率比转染效率要高出10~10倍，从而大大提高基因文库的库容量。
2. 外源DNA导入真核细胞 外源DNA导入真核细胞方法可因真核细胞种类不同而有所不同 (1) 外源DNA导入酵母细胞
一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。
(2) 外源DNA导入哺乳动物细胞
10