其二，先生产胰岛素原，并用酶切和化学裂解将其转变成胰岛素。具体过程是：将胰岛素原的mRNA经逆转录酶合成cDNA，并在cDNA的5′端加上甲硫氨酸密码子ATG。然后将cDNA插入表达载体中，转化E.coli并表达N端为甲硫氨酸的胰岛素原。将表达产物分离纯化，用胰蛋白酶和羧基肽酶B消化，切去C肽；再用溴化氰处理，除去N-端的甲硫氨酸，即得到胰岛素。
2. 重组疫苗（recombinant vaccines）
基因工程已成功开发出一系列重组疫苗，这是一类更有效更安全的新型疫苗。所谓重组疫苗是指利用重组DNA技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产物用作疫苗。
第一个被批准在人类中使用的重组疫苗是用酵母生产的乙肝表面抗原（HBsAg），它是由乙肝病毒表面蛋白抗原基因在酵母细胞中克隆和表达得到的HBsAg，实际上是中空的病毒颗粒（只含表面抗原蛋白和磷脂），经纯化后可作为乙型肝炎疫苗。
除用酵母外，昆虫细胞、哺乳动物细胞也被作为宿主，甚至植物也能产生重组疫苗。现在世界上许多实验室正在试验制备HIV的重组疫苗。
二、转基因植物(transgenic plant)
近年来，随着DNA重组技术的深入发展，科学家们已能将重组DNA导入植物细胞，并成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物。主要包括抗病虫害、抗逆（抗盐、碱等）、耐除草剂、延长水果蔬菜的贮存期等，此外还可用转基因植物生产药物（如人的干扰素）、抗体、疫苗等。转基因植物的构建主要通过Ti质粒，因此这里将主要介绍Ti质粒的改建和应用。由于Ti质粒能整合到植物染色体中的T-DNA片段，使它能够成为植物基因工程的载体。T-DNA从土壤农杆菌转移到植物细胞核内是由T-DNA两侧25个碱基对的重复序列所介导，同时还需要在Ti质粒毒性区（vir）某些基因产物（vir蛋白）的作用。其中virE2和virD2两种蛋白，可以保护T-DNA，使其免受植物细胞中核酸酶的降解，并引导T-DNA进入植物细胞核，使其整合到受体植物的基因组中。转移T-DNA进入植物基因组的这一细菌系统被用来转移重组DNA。但由于Ti质粒太大，不便于操作，因此人们构建了许多Ti质粒衍生物作为植物的克隆载体。主要有两种类型：
1.二元载体系统(binary vector system)（图10-14b）
由2个质粒组成，一个是克隆载体，另一个是辅助质粒。克隆载体通常是由E.coli的一个小质粒构成，便于进行遗传操作。其中含有T-DNA两个末端序列，它对于T-DNA的整合是必需的；还含有DNA复制起点（既有E.coli的复制起点也有根癌土壤杆菌的复制起点），使其可在E.coli和根癌土壤杆菌之间进行穿梭转移。它常含有两个选择标记基因（一个用于在植物细胞中表达，另一个用于在E.coli中表达）；此外还含有多克隆位点，便于外源DNA的插入。辅助质粒（helper plasmid）是由经修饰的Ti质粒所构成，该质粒缺失或部分缺失T-DNA区，但却含有一整套的vir基因。当外源DNA被插到克隆载体后，载体被导入E.coli中。然后通过接合转移进入土壤农杆菌中（该菌含有辅助质粒），最后外源基因由T-DNA携带在Ti衍生质粒的作用下转移至植物细胞，与染色体DNA发生重组，为植物提供了一个新的特性。
图10-14 植物基因工程图解
2.共整合载体系统(cointegrate vector system)
共整合载体(图10-14a)是由一个缺失了致瘤基因的Ti质粒与一个普通穿梭质粒载体构建而成。其中克隆载体和经修饰的Ti质粒中都含有一段同源的DNA片段。当带有外源基因的克隆载体进入土
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壤农杆菌后，通过同源重组就可以把克隆的基因整合到Ti质粒上，形成一个共整合载体，然后由Ti质粒提供vir蛋白，协助带有外源基因的T-DNA向植物细胞转移。此外，近年来已成功地发展出一些使外源DNA进入植物细胞的新技术，例如电穿孔、激光穿孔、基因枪等，这些技术使植物基因工程日趋成熟，新的改进性状的工程植物不断被创造出来。
三、转基因动物（transgenic animals）
随着现代生物技术的发展，科学家已经能够应用基因工程技术培育转基因动物，从而开辟动物育种新途径。所谓转基因动物是指用重组DNA技术和显微注射技术，将克隆DNA导入受精卵，使外源基因在实验室研究动物以及具有重要商业价值的饲养动物两者均能得到表达的动物。
构建转基因动物的主要步骤：将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；然后将接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫内；移植后的受精卵发育成为后代，其中部分后代的细胞中携带转入的外源基因并得到表达。
1982年培育转基因小鼠获得成功，使科学们受到极大鼓舞，随后对各种家禽、家畜鱼类进行基因操作，培育出一系列改进性状的新品种。转基因的瘦肉型猪、高产奶的奶牛、快速生长的家畜和鱼类等已进入实用阶段。利用转基因动物生产药物、血清蛋白、疫苗等也获成功。正在尝试培养带有人体基因的猪，使其器官能够移植人体而不被排斥。
转基因动物不仅有着广泛的应用前景，而且对于基础生物医学及发育生物学的理论研究也将起着重要的作用。
四、基因治疗（gene Therapy）
所谓基因治疗是指向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。
目前基因治疗大致有三类：
①用正常基因去弥补有缺陷的基因，用于治疗遗传性疾病。 ②通过转移基因以刺激免疫力，用于肿瘤和艾滋病的治疗。
③所转移的基因用于配合细胞或药物治疗，以便增强特异性或增强疗效。
基因治疗为临床医学开辟了崭新的领域。一些目前尚无有效治疗手段的遗传病、肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆症、恶性传染病（如各型肝炎、艾滋病等）可望通过基因治疗来达到防治的目的。1990年美国首次在临床上将腺苷脱氨酶（ADA）基因导入患者外周淋巴细胞，用以治疗因该基因缺陷而引发的重度免疫缺陷综合症（SCID），获得成功。其后在囊性纤维化（CF）、血友病、肿瘤、艾滋病等疾病的基因治疗中作了有益尝试。我国基因治疗也已取得可喜成果。1991年首例B型血友病基因治疗获得理想结果。脑恶性胶质瘤的基因治疗已完成临床前试验。目前基因治疗还有一些关键技术有待改进，主要是：如何选择有效的治疗基因，构建安全、特异和高效表达载体，将重组DNA导入人体并控制其高表达。人类基因组计划的顺利实施和“功能基因组”研究的开展必将有助于人类重要疾病基因的不断发现和基因治疗手段的提高。可以比较乐观地认为，21世纪20年代以前，基因治疗有可能成为临床医学上广泛采用的治疗手段之一，对人类战胜疾病，促进健康，将带来无尽的益处。
五、基因工程在微生物研究中的应用
基因工程技术作为微生物学研究的重要手段，有力促进了微生物学基础理论研究的发展。分子克隆和构建工程菌对了解微生物的结构与功能、微生物生理与代谢调节以及微生物生态等基本过程，提供了最好方式。通过分子克隆、限制内切酶图谱以及DNA测序等技术，使遗传学家能够快速绘制并研究微生物的基因组。利用克隆基因进行定位诱变、基因分裂（gene disruption）或敲除突变（knockout mutations），并使这些突变基因导入到微生物染色体中，有助于对突变微生物进行的研究。
基因工程技术使科学家能够给某个基因贴上\标签\（tag），以便于对该基因进行研究。例如编码β-半乳糖苷酶的基因通常被用于作为一个报导基因，它的酶活性可通过含呈色物质的指示平板
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而被检测。另一个例子是，将发光细菌（photobacterium）的细菌荧光素酶或者发光甲虫（beetles）的虫萤光素酶（luciferase）基因导入E.coli。当这些基因表达时，在琼脂平板上人们可以发现E.coli工程菌的发光菌落。测定荧光素酶需要加入ATP和荧光素。最近从一种维多利亚水母
（Aequorea victoria）分离并克隆了编码绿色萤光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的基因，GFP不需要辅助因子，在许多生物学研究中已被用作为报导者或\标签\。
六、基因工程研究展望
基因工程的兴起导致生物科学发生深刻的变化，主要表现在：第一，引发了生物科学中技术上的创新和迅猛发展。使传统生物技术，发展成以基因重组技术为核心的现代生物技术，即简称为生物技术。生物技术用于工程实践而形成了各类生物工程，主要包括基因工程、酶工程、细胞工程、发酵工程和生化工程等，其中以基因工程发展最快，应用最广。第二，技术上的重大突破，促使生物科学获得前所末有的高速度发展，开辟了新的研究领域，进入了新的研究深度。发育分子生物学、神经分子生物学、分子细胞学、分子生理学、分子进化学等学科领域的蓬勃发展。第三，为改造生物提供强有力的手段，使生物学进入创造性的新时期。从而使得在分子水平上重新设计、改造和创建新的生物形态和新的生物物种成为可能。基因工程能够带来的好处是十分巨大的。以上叙述仅涉及制药、农业和医学领域的某些方面。其实，基因工程的应用范围要广泛得多，在食品、化工、环保、采矿、冶炼、材料、能源等众多领域都有诱人的开发前景。它将在人类实践中发挥更大作用和贡献。当然，它也和其它所有新生事物一样，在它给人们带来巨大利益的同时也面临着严峻的挑战。基因工程与传统生物技术的最根本的区别就在于前者是在基因水平上进行操作，改变已有的基因甚至创造新的物种，这是一项前无古人的崭新的工作。因此，基因工程是否具有潜在的危害性，特别是转移至人体的基因是否会激活原癌基因，基因工程是否会导致出现新型病原生物等问题必然也成为人们关心和争议的焦点，也是当前的研究热点之一。但有一点可以肯定，人们既然能发明一种新技术，必然也将会有能力掌握这门新技术，使它朝着人类进步的方向发展。
噬菌体展示技术*
噬菌体展示技术（phage display）是将外源基因插入到噬菌体展示载体上，一般使用丝状噬菌体，并使其与编码噬菌体外壳蛋白因相连接，从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌体的表面，被展示的多肽蛋白质可保持相对的空间结构和生物活性。
噬菌体展示是一种基因表达和对表达产物亲和选择相结合的技术。常以一组随机多肽编码序列或基因群插入噬菌体展示载体，形菌体展示文库。在噬菌体展示文库的每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链，图10示外源基因克隆进M13展示噬菌体中，与外壳蛋白Ⅲgp3连接后，所表达的融合蛋白展示在噬菌体表面的情况。噬菌体展示文库中挑选出带有外源基因的重组噬菌体。一般采用亲和选择方法，如免疫亲和层析或ELISA等方法，获得带有外源多肽或蛋白质的重组体，并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌而得到进一步的扩增。此外，还可从重组噬菌体DNA中切出外源基因再克隆到其他宿主细胞中表达以获得大量外源基因产物。
噬菌体展示技术是在90年代初才兴起的重要生物技术，由于该技术大大地简化了抗体库构建及单克隆抗体筛选过程，很快在人工体制备方面得到应用，并迅速扩展到生物学其它许多领域，例如确定抗原决定簇；用以研究蛋白质的相互识别和相互作用；分离特构与功能的蛋白质；由多肽构象或蛋白质突变库获取特定功能蛋白质等。目前，表面展示技术已扩展到其它微生物，如细菌展示系统母展示系统、以及其它病毒展示系统，并已成为竞相研究地热点*。
图10-15 噬菌体展示的示意图
* 1)Schreuder,M. P. et al., TIB Tech,1996,14:115~120 2)Boullk,Y. Et al., Biotechnology,1995,13:1079~1084
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小 结
1. 基因工程，即DNA重组技术，是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学和工程学原理和方法而开拓的新兴技术领域。它的出现促使生物技术迅猛发展，改变了生物科学面貌，并带动了生物技术产业的兴起。
2. 基因工程的操作主要包括：基因的分离、合成和重组，基因的分子克隆，基因的测序和鉴定，基因的体外扩增和定位诱变，基因的表达等技术。
3. 基因克隆载体通常由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成，并需选择适当微生物作为克隆基因的宿主。微生物为基因操作提供了各种工具酶。
4. 为使外源基因表达，必需在克隆载体中安置宿主细胞控制表达的元件，包括启动子和其调控序列、翻译控制序列和终止信号。或者将外源基因整合到染色体DNA中。基因表达已获得广泛应用。
思 考 题
1、 在基因工程中，为什么需要克隆载体与表达载体？他们各起什么作用？各需要具备哪些基本遗传元件？
2、 讨论由于原核生物和与真核生物基因结构不同，为什么会妨碍哺乳动物基因在原核生物中的表达？可采取什么措施加以解决？
3、 外源蛋白表达时，为什么需要基因表达调节开关才能实现高效表达？噬菌体 PL启动子在cI ts 857作用下，可受温度调节；Lac UV5启动 子在Lac I作用下，可受IPTG调节。两者诱导表达机制有何不同？
4、 在筛选阳性克隆时，为什么采用能引起lac Z′插入失活的克隆载体比用能引起抗生素抗性基因插入失活的克隆载体更为有效？
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