4. 包函体(inclusion body)
当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包函体。在利用大肠杆菌生产非融合蛋白的过程中，多数情况下外源蛋白是以包函体的形式存在的。
包函体的形成有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对外源蛋白的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害作用。此外包函体也有利于表达产物的分离。但是包函体形成后，表达蛋白不具生物学活性。此外由于外源蛋白形成包函体，影响负责N端加工的酶对表达蛋白的加工作用。
为了获得可溶性的活性蛋白，通常在经过差速离心得到包涵体后，必须进行变性和复性处理，以便得到具有正确构象和有生物活性的蛋白质产品。
四、融合蛋白的表达
所谓融合蛋白是指蛋白质的N端由宿主基因（通常只是N端的部分序列）编码，C端由外源基因编码。换言之，融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。
1. 融合蛋白的表达载体(expression vector of fused protein)
为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达载体中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致，翻译才不会产生移码突变。通常，可构建一套表达载体，第一个载体有正常阅读框架，第二个载体多了一对碱基，第三个载体多了二对碱基。选择上述三种载体之一并与外源基因连接，以保证外源DNA阅读框架的正确。（图10-10）。
图10-10融合蛋白表达载体
2. 表达融合蛋白的优点
(1) 融合蛋白较易获得高效表达
这是由于AUG后大约20个核苷酸对翻译有较明显的影响。而融合蛋白的N端总是选择天然存在高表达的宿主蛋白质，其mRNA具有较强的翻译能力。
(2) 融合蛋白在细胞内比较稳定
外源蛋白特别是分子量较小的蛋白，通常在宿主细胞内极易被胞内的蛋白酶所清除。但是如果外源蛋白与宿主的一个蛋白构成融合蛋白。这样就可保护外源蛋白不受宿主细胞降解。
(3) 许多融合蛋白可用作抗原
有时用较小的肽段作为抗原时，必须使其成为融合蛋白。
尽管有上述种种优点，在多数情况下，人们还是愿意表达非融合蛋白，这是因为融合蛋白产物要用化学法或酶法切去融合的多余肽段，给后处理工序增添了麻烦。
3. 融合蛋白中目的蛋白的分离纯化
目前采用两种方法，从融合蛋白中分离出目的蛋白： (1) 酶法
可在细菌蛋白和真核蛋白之间加入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列。例如Ile-Glu-Gly-Arg可被凝血因子Xa识别并在C端切开。
(2) 化学法
在基因工程胰岛素生产中可在胰岛素与细菌蛋白之间加入甲硫氨酸，然后用CNBr切割融合蛋白，结果在甲硫氨酸处被专一切开，形成一条细菌蛋白链和另一条胰岛素链。
第六节 DNA的合成、体外扩增和定位诱变
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DNA的化学合成、体外扩增和定位诱变是按照设计获得基因分子序列和对基因改造的关键技术。DNA的化学合成方法是科拉纳（Khorana）于50年代建立的，其后作了改进并最先合成了基因片段。因此而于1968年获得诺贝尔医学奖。1984年穆利斯（Mullis）建立聚合酶链式反应（PCR）技术，为基因的体外扩增提供了十分简便的方法，1985年史密斯（Smith）建立了寡核苷酸指导的定位诱变技术，率先实现了对基因的定向改造。 为表彰穆利斯和史密斯对基因操作技术的重大贡献，他们两人共获1993年诺贝尔化学奖。现在，DNA的合成、测序和PCR扩增都有自动化的仪器，定位诱变也可用PCR方法来完成，这标志着基因工程技术上的逐步成熟和完善。
一、DNA的合成
如果已知某种基因的核苷酸序列，或某种蛋白质的氨基酸序列，就可通过化学法合成这一基因。1977年板仓敬一首先用化学法合成了14肽的生长激素释放抑制因子的基因，并获得克隆和表达成功。化学合成法自DNA合成仪问世后，已实现完全自动化，在几个小时内可合成30～35个碱基的寡核苷酸。目前化学合成寡核苷酸片段能力约为150～200个核苷酸左右。基因的化学合成是先合成许多寡核苷酸，彼此交错互补，然后再将它们连接起来。
合成的DNA分子被广泛用于基因工程的不同目的：
①作为合成基因的元件。通过寡核苷酸片段连接，现已能构建长达2000bp的基因序列。 ②作为核酸分子杂交的探针，通过核酸杂交用于检测和分离特殊的DNA序列。 ③合成引物，用于测序、定位诱变和PCR扩增等。 二、PCR扩增技术的原理和应用
穆利斯发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）,这是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。过去人们为了得到某一特定DNA序列，按传统方法需将目的基因插入到载体中，再将此重组DNA导入宿主细胞中，经过筛选和鉴定等操作获得目的基因的克隆。而PCR技术只需数小时，就可在体外将该特定基因扩增百万倍，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。
1．PCR扩增技术原理
如果DNA片段两端的序列是已知的，那么采用聚合酶链式反应（PCR）就可很容易将此DNA片段扩增出来。进行PCR需要合成一对寡聚核苷酸作为引物，它们各自与所要扩增的靶DNA片段的末端互补。引物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列。PCR由3个基本反应组成（图10-11）。
图10-11聚合酶链式反应（PCR）
（1）变性（denaturation）
加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。 （2）退火（annealing）
使温度下降，寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。 （3）延伸（extension）
在适宜条件下，引物3￠ 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
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这样，变性、退火和延伸构成一个循环，新合成的DNA链又可作为模板进行下一个循环的复制。重复变性、退火和延伸三步操作，DNA片段呈2的指数增长，在1－2小时内重复25－30次循环，
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扩增的DNA片段拷贝数可增加至10～10倍。
值得指出的是，最初PCR技术，使用Klenow聚合酶，此酶主要的缺点是不耐热，在PCR过程中，高温使酶变性，因此反应中每个循环都需添加酶；此外，该酶的最适反应温度是37℃，在此温度下增加了引物与DNA之间非特异碱基配对，从而降低PCR产物特异性。
1988年萨奇（R.K.SaiKi）等人从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中成功分离到一种耐热的DNA聚合酶，称为Taq DNA聚合酶，一次加酶即可满足PCR全过程需求；同时简化操作并提高了PCR产物特异性。此酶在PCR技术中被广泛应用。缺点是该酶缺乏校正功能。
最近已陆续发现一些既耐热且具有校正功能的DNA聚合酶，一种是从火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分离到的，称为pfu DNA聚合酶；另一种从Thermococcus litoralis中分离到的，称为Vent DNA聚合酶。这些酶已被用于PCR反应。
3. PCR技术的应用
PCR技术具有十分广泛的实际用途：
（1）可用于DNA的扩增和克隆：制备单链或双链DNA探针；也可用于定位诱变和DNA测序。 （2）在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。
（3）用于法医，以鉴别个体和判定亲缘关系。当用多对引物进行PCR时，可得到对个体特定的条带图谱，称为指纹图谱（DNA fingerpinting）。从作案现场得到的痕量血液、体液、毛发、皮屑等。经PCR得到指纹图谱即可用来指证嫌犯。DNA指纹图谱还能确定个体间的血缘关系。
由于PCR技术操作简单、实用性强、灵敏度高，并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究，以及临床医学、法医和检疫等实践领域得到日益广泛的应用。
三、DNA的定位诱变
随着分子生物学的进步，尤其是基因克隆技术的广泛应用，人们不仅能将外源基因导入生物体内，改变生物性状，而且已有可能通过体外定位诱变（site-directed mutagenesis）方法，特异改变克隆基因或DNA序列。与传统方法用诱变剂随机发生作用不同，定位诱变用合成的DNA和重组DNA技术在基因精确限定的位点引入突变，包括删除、插入和置换特定的碱基序列。定位诱变技术具有重要应用价值，它不仅用于基因结构与功能研究，而且还能进行分子设计改造天然蛋白质，即通过有目的的改变蛋白质分子中的特异氨基酸，从而获得有益的蛋白质突变体。现将几种主要的定位诱变技术介绍如下：
1. 寡核苷酸指导的诱变
该方法的基本原理是，合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有所需要改变的碱基，使与带有目的基因的单链DNA配对。合成的寡核苷酸除短的错配区外与目的基因完全互补。然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条链为突变型子代链。将获得的双链分子通过转染导入宿主细胞，并筛选出突变体，其中基因已被定向修改。
寡核苷酸指导的定位诱变过程由的示意图（图10–12），用于定位诱变的常用载体是噬菌体M13 DNA。在克隆外源基因时，需要从已感染M13的大肠杆菌细胞中提取M13双链复制型DNA，外源基因才得以插入；而在定位诱变时，则需从培养液中分离出M13的重组噬菌体，并从中提取出携带外源基因M13的单链重组DNA。然后再进行体外定位诱变，获得含有错配碱基完整双链M13DNA，转染大肠杆菌，M13在大肠杆菌中扩增，形成噬菌斑。理论上一半是野生型，另一半则含突变基因。用诱变的寡核苷酸引物作为探针，通过杂交即可鉴定出突变体。现在已有一些改进的方法，可用来提高寡核苷酸指导的诱变效率。
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图10-12 寡核苷酸指导的定位诱变
2. 盒式诱变
当今的DNA合成技术已经能够对任意的变异基因予以全合成。但全合成耗费太大，实际上只要在变异区附近找两个限制位点，将两者之间的DNA序列切掉，并由一段带有变异序列的双链DNA所取代，就能达到诱变目的。所谓盒式诱变（cassette mutagenesis）就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。这就好象用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样，故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式诱变。然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入限制位点。
3. PCR诱变
在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱基，便可使PCR产物的末端引入突变。
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例如，为了克隆PCR产物，常在引物5端设计一个限制酶的位点，结果就使该限制位点引入PCR产物的末端。但是，诱变部位并不总在DNA片段的末端，有时也希望对靶DNA的中间部分进行诱变。1988年希古契（Higuchi）等人提出一种借助重组PCR（recombinant PCR）进行定位诱变的方法，可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。 它在需要诱变的位置合成两个带有变异碱基的互补引
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物，然后分别与5引物和3￠ 引物作PCR，这样得到的两个PCR产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物（见图10－13）。
图10-13 PCR定位诱变
任何基因，只要两端及需要变异部位的序列已知，就可用PCR诱变去改造该基因的序列。方法简便易行，结果准确、高效，因此已成为最常用的定位诱变方法，PCR诱变方法已有许多改进和发展，即使很大的基因，也能用该法定点引入变异。
第七节 基因工程的应用及展望
70年代兴起的基因工程，标志着人类改造生物进入一个新的历史时期。由于基因工程的迅速发展和广泛应用，它不仅对生命科学的理论研究产生深刻的影响，而且也为工农业生产和临床医学等实践领域开创一个广阔的应用前景。
基因工程正在或即将使人们的某些梦想和希望变为现实。基因工程被广泛应用于生产实践，带动了生物技术产生高速发展。现就基因工程一些重要的应用简略叙述如下：
一、基因工程药物
基因工程药物包括一些在生物体内含量甚微但却具有重要生理功能的蛋白质，如激素、酶和抑制剂、细胞因子、抗原和抗体、反义核酸和疫苗等。此外，还可利用重组DNA技术改造蛋白质，设计和生产出自然界不存在的新型蛋白质药物。表10-3列出一些具有重要临床应用价值的重组蛋白质药物。其中，重组胰岛素是作为商品于1982年最早投放市场的基因工程药物；重组疫苗是目前最普遍使用的基因工程药物。这里仅对这两类药物作一介绍。
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表10-3 利用基因工程生产的人类蛋白质药物
蛋 白名 称 酶与抑制剂 尿激酶（urokinase） a -1-抗胰蛋白酶（a -1－antitrypsin） 溶菌酶（lysozyme） 血液蛋白 促红细胞生成素（erythropoietin） 凝血因子 组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator） 人类激素 表皮生长因子（epidermal growth factor） 促滤泡素（follicle stimulating hormone） 人生长激素（human growth hormone） 胰岛素（insulin） 松弛素（relaxin） 免疫调节剂 干扰素(interferon) 白细胞介素（interleukin） 集落刺激因子（colony stimulating factor） 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor） 用 途 溶栓剂 治疗肺气肿 抗炎症 治疗贫血 促进血凝 溶栓剂 促进伤口愈合 治疗生殖失调 促进生长 治疗糖尿病 助产剂 抗病毒、抗肿瘤 激活、刺激各类白细胞 治疗感染和肿瘤 抗肿瘤 疫苗 乙肝（hepatitis B） 麻疹（measles） 狂犬病（rabies） 预防乙型肝炎 预防麻疹 预防狂犬病 1. 重组胰岛素 (recombinant insulin) 胰岛素是在胰脏的胰岛中产生的一种小分子蛋白质，它能提高组织摄取葡萄糖的能力，具有降低血糖的作用，可用于治疗人的糖尿病，现在已能在细菌中克隆人胰岛素基因并用于大规模生产。基因工程生产人胰岛素有两种技术路线。
其一，首先分别化学合成编码胰岛素A链和B链的基因序列，两条链的5′端各加甲硫氨酸密码子ATG，以便表达后加工。然后将合成的A、B链DNA序列分别插入到质粒载体的β-半乳糖苷酶基因中，克隆基因受β-半乳糖苷酶基因启动子控制。重组质粒转化E.coli，分别表达A链或B链和β-半乳糖苷酶的融合蛋白。由于甲硫氨酸位于融合蛋白的连接处，在体外用溴化氰裂解甲硫氨酸，即可使A链或B链与β-半乳糖苷酶片段分开。然后A链和B链通过二硫键连接，形成具有活性的胰岛素。
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