其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。由于有些动物细胞体积较大，如受精卵用微量注射器可将外源DNA注入细胞内。电穿孔(electroporation)法是把宿主细胞与外源DNA混合并置于电击槽中。在高压电脉冲作用下，使细胞膜瞬时击穿出现微孔，外源DNA通过微孔进入细胞。电穿孔法十分成功用于哺乳动物细胞和植物细胞，而且也可用于通常不能进行转化的细菌。大肠杆菌应用电穿孔法也可提高转化率。
此外还有磷酸钙共沉淀转染法，DEAE-葡聚糖转染法、聚阳离子转染法、原生质体融合法、脂质体法等。
(3) 外源DNA导入植物细胞
除了通过微量注射法及电穿孔法可将外源DNA导入植物细胞外。还有两种方法，一种是将含有重组Ti质粒的土壤农杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片共培养（即叶片培养法），多数双子叶植物转化常用此法；另一种是基因枪法或称微弹枪（particle guan）法，利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞或组织，可直接将外源基因导入幼苗，此法简便、有效。故颇受欢迎和被广为应用。
五、基因文库与cDNA文库的构建
利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库(genomic library)或cDNA文库(cDNA library)之中，就好像将文献资料贮存于图书库一样。以供长期贮存和随时钓取克隆基因使用。
1. 基因文库的构建
由于高等生物染色体基因组结构复杂，分子庞大，而单个基因却只占染色体DNA的很小部分。若要从巨大染色体基因组中分离某一目的基因，通常需经过两个步骤：首先构建一个基因文库，然后根据目的基因的性质或序列从基因文库中筛选出来。
所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。
基因文库构建的简单步骤（图10-7）： ①从组织或细胞提取基因组DNA。
②用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段。
③选择容载量较大的克隆载体，通常采用l 噬菌体或柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开。 ④将基因组DNA片段与载体进行体外连接。
⑤重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组l 噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。
图10-7 基因文库构建示意图
2. cDNA文库构建
所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。
如上所述由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常
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大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。
构建cDNA文库的主要步骤（图10-8）： ①从生物体或细胞中提取mRNA。
②利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链。
③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链。常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物；或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链。
④cDNA与载体的体外连接。
⑤噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。
cDNA文库对克隆和表达真核生物基因更加重要。因为真核生物的基因含有内含子，在原核生物细胞中不能表达，但筛选到的cDNA克隆只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。此外，cDNA还代表了基因组表达的遗传信息。
图10-8 cDNA文库构建示意图
六、重组体的筛选与鉴定
在构建文库之后，就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。概括起来通常有三类鉴定方法，一是重组体表型特徵的鉴定。二是重组DNA分子结构特徵的鉴定。三是外源基因表达产物的鉴定。
1. 重组体表型特征的鉴定 (1) 抗生素平板法
如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上进行培养，仍可长出菌落。此外，还有一些自身环化的载体和未被酶解的载体，他们的转化细胞也能在含该抗生素平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性率高。
(2) 插入失活法 见第二节图10-3。 (3) 插入表达法
在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。例如质粒pTR262有一个负调控的cI基因，当外源DNA片段插入cI基因中的BcII或Hind III位点，造成cI基因失活，位于cI基因下游的Tet基因（受cI基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；而未被酶解的质粒，自身环化质粒的转化细胞及未转化受体细胞均不能形成菌落。
(4) β-半乳糖苷酶显色反应法
在某些载体如M13噬菌体载体，pUC质粒系列、pGEM质粒系列，它们的载体上都携带lac z'基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主细胞为lac z△M15的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有X-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色。
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若将外源DNA插入到载体上lac z￠ 序列中，使α-肽基因失活，失去α－互补作用，将重组体转化细胞培养在含有X-gal-IPTG平板上，菌落无色。利用β-半乳糖苷酶显色反应即可挑选出含有外源DNA重组体的阳性克隆。
2. 重组DNA分子结构特征的鉴定
(1) 菌落（或噬菌斑）原位杂交(in situ hybridization)
将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。通常影印的滤膜必须有双份，在一张滤膜上找到阳性克隆后，可在另一张滤膜的相应位置上找到活的细菌或噬菌体克隆。此法优点可在短时间内从成千上万克隆中快速筛选到阳性克隆。
(2) 内切酶图谱鉴定
将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1至2种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。
(3) PCR鉴定
通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒DNA作为模板进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段大小及鉴定其序列特异性。
(4) DNA序列测定
最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。 3. 外源基因表达产物的鉴定 (1) 表达产物免疫活性测定
如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作极似菌落（或噬菌斑）原位杂文。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联（酶标），那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。
(2) 表达产物生物活性检查
可根据表达产物不同情况采用不同方法检测其生物活性。若表达产物是一种酶，则可测定其酶活性；若所表达蛋白质是一种酶的抑制剂，则可测定其抑制酶活性能力的大小等等。
(3) 表达产物氨基酸序列测定
测定表达产物“N”端氨基酸序列，对表达产物的鉴定具有特别重要意义。
第五节 表达载体的构建
基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变动、植物遗传性状。 所谓表达载体(expression vector)是指具有宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求。但是原核生物和真核生物的基因表达调控机制有很大不同，故需要分别采用原核生物和真核生物的调控元件来构建。
当真核生物基因在原核细胞中表达时，表达产物有两种形式，一种是非融合蛋白，另一种是融合蛋白。两种形式各有利弊，在进行基因工程时可根据具体情况进行设计。
一、表达系统的要求与主要调控元件
真核细胞基因在原核细胞中表达将遇到一系列困难：真核生物的启动子不能被原核细胞的RNA聚合酶所识别；真核生物的mRNA上没有SD序列，因此不能被原核细胞核糖体结合；真核生物的基因含有内含子，原核细胞缺乏将它们的转录物进行拼接加工的机制；真核细胞的基因产物，往往需
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要翻译后加工，原核细胞缺乏有关的加工酶；真核生物基因表达的蛋白质易被原核细胞蛋白酶所降解等等。
因此在用原核细胞表达真核生物基因时，应注意以下三个问题：①基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的cDNA。②基因必须置于原核细胞启动子、终止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别。③产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解掉。
表达系统的要求与主要调控元件包括：启动子、核糖体的结合位点、转录终止信号和密码子偏爱性等。
1. 启动子(promoter)
启动子是指RNA聚合酶结合于DNA并起始合成RNA的一段DNA控制序列。原核基因启动子位于转录起点（transcription initiation point）上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。一个称为－10区，位于转录起点上游约10bp处；RNA聚合酶于该处解开DNA双链，并决定转录起点；另一个称为－35区，位于转录起点上游约35bp处，是RNA聚合酶识别并结合的位点。
目前在原核表达系统中使用最普遍的强型可调控的启动子主要有以下5种： ①lac启动子，是乳糖操纵子的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调节控制； ②trp启动子，是色氨酸操纵子启动子，受trpR编码的阻遏蛋白调控。
③tac启动子，由lac启动子的- 10区和trp启动子的- 35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，同样受lac I阻遏蛋白调控。
④PL、R启动子，是λ噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控。
⑤T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多并且十分专一，只被T7RNA聚合酶所识别。 2. 核糖体结合位点(ribosome-binding site)
原核生物mRNA结合核糖体的序列最初是由夏英（Shine）和达尔加诺（Dalgarno）发现的，因此称为SD序列。在大肠杆菌中，核糖体结合位点包括起始密码子（AUG）及位于起始密码子上游3-11bp处，长度为3-9bp的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸刚好与核糖体小亚基上16S RNA3' 端一段富含嘧啶的保守序列互补，从而带动核糖体与mRNA的结合。不仅SD序列对翻译效率有明显影响，SD序列与起始密码子之间的序列和距离对翻译效率也有影响。这种影响对不同基因是不一样的，因此在构建重组体时必须进行具体试验。
3. 转录终止子（terminator）
转录终止子是指一段位于基因或操纵子的3'末端，具有终止转录功能的特定DNA序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。
4. 密码子的偏爱性
由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。在原核生物细胞中，对应于tRNA丰富的密码子称为偏爱密码子（biased codons），而对应tRNA稀少的密码子称为稀有密码子（rare codons）。
不同生物对各种密码子的使用频率不同，高等动、植物中使用频率高的密码子可能在原核细胞中被用得很少。因此在基因工程必须根据宿主生物偏爱密码子改造基因的编码序列，才能得到高表达的效果。目前已能利用人工合成DNA或基因的定位诱变，以便创造一个基因更适合于宿主密码子的使用类型。
二、表达载体中调节开关的作用
通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；此外某些载体所用的启动子是强启动子，例如T7启动子，它的表达非常强以致使正常宿主基因不能表达。基于以上事实，宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至
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获得足够量的细胞。第二阶段是启动调节开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。
在原核基因表达调控中，阻遏蛋白-操纵基因系统起着重要调节开关的作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导物，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。
外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导两种方法： 化学物质诱导
当用lac启动子构建表达载体时，lac启动子受CAP蛋白和cAMP的正调控。受阻遏蛋白的负调控；当宿主细胞生长时，lac I基因产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，阻碍外源基因的转录和表达，此时细胞大量生长和繁殖。加入诱导物IPTG后，由于诱导物与阻遏蛋白结合，使其不能与操纵基因结合。于是，外源基因被诱导而高效转录和表达。现在基因工程所用lac启动子常用其经紫外诱变改造的启动子lac UV5。该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录。
温度诱导
当用λPL、R启动子构建表达载体时，PL、R启动子受λ噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。目前利用cI的温度敏感突变基因（cI 857 ts）调节这种阻遏。当在28-30℃培养时，该突变体产生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R转录，细菌大量生长。在获得足够量菌体后，使温度上升至42℃，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。
三、非融合蛋白的表达
所谓非融合蛋白是指外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。 1. 非融合蛋白表达载体(expression vector of unfused protein)
为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子ATG的真核基因插入到合适的原核启动子和SD序列下游（图10-9）。经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。
图10-9 非融合蛋白表达载体
2. 防止非融合蛋白降解的措施
表达非融合蛋白的优点是能够直接产生天然的外源蛋白。但也存在一些缺点，主要是它容易被细菌细胞内的蛋白酶所降解，从而造成表达产量降低。为了保护真核蛋白质免受降解，一般可采用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白的宿主菌，或者利用胞内蛋白酶抑制剂使受体细菌的蛋白酶受到抑制。此外，设法将外源蛋白分泌到胞外或形成包函体等方法也都可以防止外源蛋白的降解。
3. 外源蛋白的分泌表达
如果合成的外源蛋白能不断从细胞分泌出来，不仅可免受宿主细胞中蛋白酶的降解，而且有利于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。
分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。通常信号肽与外源蛋白的N端连接，由于信号肽中含有带正电荷的氨基酸和疏水氨基酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。
目前已知真核生物的分泌蛋白，大多能在大肠杆菌中得到很好分泌，此外一些小分子量的多肽也能较好分泌，但是对于原来属于真核生物的非分泌蛋白，即使装上信号肽，也常不能被分泌到周质或外膜内，最多只能结合到细胞内膜上。因此考虑外源蛋白分泌表达时，首先须考虑该表达蛋白被分泌的可能性。
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