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附录B
（资料性附录）
病毒去除和/或灭活研究指南
B.1 假定病毒的去除和/或灭活遵循随机性的概念，因此不可能保证产品的绝对无污染。
当检测低病毒浓度的能力从统计意义上取决于样品的大小时（见附录F），所有试验都有定量媒介分析局限性。
组织上或组织内无相关病毒的确定，不只是依赖于检验来确定它们是否存在，还可以通过证实生产步骤能将其灭活或去除来确定。 B.2病毒的选择
B.2.1进行去除和/或灭活研究时，关键是选择所要使用的病毒。宜尽可能包括相关病毒。如果相关病毒的使用无法证实所需的大范围的性能，则宜使用模型病毒进行确认。
B.2.2用于去除和/或灭活研究的模型病毒，应选择代表尽可能接近可能污染产品的相关病毒和代表尽可能大的理化性能范围的病毒，以检验生产过程对病毒灭活的能力。源材料和生产过程的质量和特性也会影响到模型病毒的选择。
B.2.3在有两个可能的病毒由于它们的特性等于或近似于可能的污染而会被用于一个特定的去除和/或灭活步骤的研究的情况下，宜选择其中抗力较高者，除非另有验证。
注：虽然源材料未必是具体模型病毒的寄主，但对此类病毒获得的降低值通常却对去除和/或灭活病毒生产过程的
能力方面提供有用信息。
B.2.4宜对灭活研究过程中模型病毒的持续恢复能力予以考虑。 B.2.5可能情况下，宜选择能增长到高滴定度的病毒。 注：这未必总是可能的。
B.2.6宜在通过一个生产步骤的前后，对所选病毒进行有效性、敏感性和可靠性的检测分析。 B.2.7宜考虑某些病毒可能会对从事确认研究的人员造成的健康危害，需采取适宜的保护措施。 注：93/88/EEC适用（见参考文献）。 B.2.8在灭活确认研究中已使用的和已推荐使用的病毒模型见表C.1的举例。
B.2.9在灭活确认研究中已使用或已推荐使用的传播病毒模型的实例是羊痒病菌株263K,139K,22C,ME7和87A。
B.3去除和/或灭活研究的设计和内容 B.3.1总则
去除和/或灭活研究包括，在各生产步骤中人为加入一种病毒（使携带）和在每个生产阶段之后或在所有生产步骤之后对灭活程度的测量。没有必要对生产过程的每个生产步骤进行确认。只有对那些其主要目的是对病毒进行去除和/或灭活的生产步骤才有必要对其进行去除和/或灭活的研究。当一个过程包含了许多生产步骤，而每个步骤都含有小的降低因素时，则必须对全过程进行确认（见C.3.5）。
宜对各生产阶段的精确定义给予认真考虑。 宜避免将任何病毒物人为引入生产设施。这一确认工作应在单独配备的实验室中进行，通常采用小规模的生产过程，并由具备适宜资格的和有经验的人员操作。 B.3.2研究的设计
B.3.2.1宜对保证检测可靠性的病毒最少可检测量应予以考虑。
B.3.2.2病毒灭活/去除的有效性取决于材料的结构、大小和形状以及它们在其中的分布。在研究设计中宜对此予以考虑。
B.3.2.3为了能准确测定某个生产步骤的灭活/去除能力，加入到被研究的生产步骤的原材料上的病毒数量宜尽可能多。然而，所加入的病毒悬液的体积宜不超过所有要使携带病毒的产品的10%，从而试验样品的携病毒的量与生产材料保持相近。计算的降低系数宜是基于该携带病毒的原材料中可检测病毒的
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量，而不是基于所加入的病毒的量。
B.3.2.4模型试验样品中的病毒宜尽可能无需进一步操作（如过分离心、透析或储存）而直接能用滴定法测定。在必须进行进一步处理时，如：消除或中和抑制因子或毒性物质，或储存一段时间来确保所有样品能一起用滴定法测定，则宜采用适当的对照，以确定这些过程对研究结果的影响，如稀释影响。监测系统中样品的影响，包括毒性反应，也会对检测限带来影响，因此宜予以记录。 B.3.2.5应尽可能获取到病毒灭活的动力学资料，以便测量出曲线的斜率和确定灭活全部病毒所必须的理论时间。灭活研究宜这样来策划，即在不同的时间采样，从而建立灭活曲线。通常开始阶段病毒灭活较快，然后跟有一个缓慢阶段。主要是以第二阶段的研究来表征灭活过程（见C.4.1c）。
B.3.2.6在采用去除法的情况，如：使病毒分解成沉淀物来降低病毒传染性或通过某些分馏将其去除，宜对去除后的样品进行研究。宜尽可能给出不同碎片病毒的平衡分布。
B.3.2.7病毒的定量传染性分析方法宜有充分的敏感性和再现性，并宜进行足够的重复试验和对照，以确保结果具有足够的统计意义上的精确性（见附录E）。
B.3.2.8获得的对数降低的有效性宜根据关键过程参数的变化对过程极限影响的研究来予以确立。 B.3.3病毒模型病毒培养
通常用于确认灭活过程的病毒模型病毒最好是在可得细胞培养物中形成。所选择的细跑培养系统宜不改变病毒模型病毒的特性。 B.3.4细胞培养试验的进行
B.3.4.1通常用于确认灭活过程的病毒模型病毒首选在细胞培养物中试验。宜使用允许细胞（permissive cell）模型对不同生产步骤灭活能力进行试验。
B.3.4.2细胞内病毒通常比细胞外病毒难以灭活。方法中采用充许细胞，可以对灭活过程参数的有效性进行检验。
B.3.4.3对那些即便是在受过所选病毒模型病毒感染的培养物中也不能恢复出感染性病毒的点，也宜进行该试验。 B.3.5降低系数
B.3.5.1去除和/或灭活研究的目的是确定在病毒的灭活和/或去除步骤的有效性，测量出生产过程中灭活/消除病毒的总的能力。总降低系数一般为各降低系数之和。不过，各降低系数的简单相加不一定合理，尤其是在病毒的抗性不完全知晓的情况下。在一个过程阶段中病毒滴定度的降低等于或小于1 log被认为是很小宜被忽略不计。生产厂应从对消除起作用但有较小可靠性的过程阶段中区分出有效阶段。同时还宜考虑一个阶段残存的病毒是否能抵抗下一个阶段，或换句话说已经增加了抵抗力。例如，已发现传播病毒经甲醛处理后增加了它们对热的抵抗力。通常，具有大作用的一个阶段比总作用相同的多个阶段更具有安全保证。
B.3.5.2对于所有病毒而言，生产厂应验证获得的降低系数的可接受性。应考虑以生产过程进行总体检验，适当时，证实病毒灭活和/或去除过程总的能力（在始料中加入最大污染的模型病毒，经过过程运行，最后对产品试验）。
B.4去除和/或灭活研究的局限性
B.4.1去除和/或灭活研究对于风险分析和风险管理是有用的，从而确保建立医疗器械安全性的可接受水平。然而，在去除和/或灭活研究的设计和执行中许多因素将导致病毒去除和/或灭活过程能力的不正确估计。这些因素包括以下方面：
a) 不同实验室的病毒株可能对相同处理敏感性有所不同；
b) 对用于确认去除和/或灭活步骤的病毒是在组织培养中制备的情况，去除和/或灭活研究中组
织培养出的病毒的特性可能与天然病毒有差异（例如自然病毒和培养病毒在纯度和聚集程度不同）；
c) 全部生产过程降低感染性的能力通常用每一阶段降低系数取对数的总和表示，尽管这是计算
总降低系数的有用方法，但有些情况下对数换算值相加可能没有效（如：在降低受换基体吸
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附的影响时）；
d) 对病毒感染性的灭活经常遵循一个两阶段曲线，开始是快速阶段，然后进入缓慢阶段。原因
可能是经受一个特定灭活阶段存活下来的病毒提高了对下一个阶段的抵抗力。其结果是，总的降低系数不一定等于各阶段（每次接种新病毒）降低系数之和。例如：如果该抗力是采取聚集的形式而得以提高，其感染性可以不同程度地抵抗固定（fixation）和灭菌处理； e) 如果灭活曲线与历史数据相比不够典型，宜给予特别考虑；
f) 对滴定度降低取对数表示降低系数，说明残留病毒感染性大幅度降低，但其数值永远不可能
降至零。
B.4.2尽管设计小规模过程（见附录B），但小规模过程仍与实际规模过程有所不同。
B.4.3在某些环境中，材料中可能存在抗体或妨碍/相互作用模型病毒的其他分子。这可能会影响病毒的分离或影响其对灭活的敏感性；但也可能由于抵消了其感染性使研究设计复杂化。研究设计的适当性可能很难判断。所含抗体的水平可被认为是一个重要的过程变量。
对期望所有的模型病毒被去除或灭活的样品，宜对抗体或妨碍/相互作用模型病毒的其他分子进行检测。某些情况下，不可能把灭活作用和妨碍/相互作用影响分开。
B.4.4生产参数的微小差异，如蛋白质含量或温度，会因种种机理而对病毒感染性的降低带来较大的差异。
表B.1—用于病毒确认研究的病毒示例 病毒 脊髓灰质炎病毒 萨宾1型 脑心肌炎病毒（EMC） 呼吸道肠道病毒3 科 小核糖核酸病毒科 小核糖核酸病毒科 呼肠孤病毒科 天然 宿主 人 类别 基因组 包裹 无 大小 nm 25至30 形状 二十面体的 二十面体的 球面的 二十面体的 二十面体的 球面的 多/球状的 球面的 弹丸形的 二十面体的 多/球面状的 球面的 球面的 耐理 化性 中 肠道病毒 RNA 鼠 心病毒 正呼肠孤病毒 多瘤病毒 RNA 无 25至30 中 各类 RNA 无 60至80 中 猿猴病毒 乳多空病毒科 猴 犬 猪 鼠 DNA 无 40至50 非常高 细小病毒（犬、猪） 鼠白血病病毒（MuLV） 牛病毒性腹泻病毒（BVDV） 人类免疫缺陷病毒 疱疹性口炎病毒 细小病毒科 微小病毒 DNA 无 18至24 非常高 逆转录病毒科 C型肿瘤病毒 RNA 有 80至110 低 披盖病毒科 逆转录病毒科 弹状病毒科 小核糖核酸病毒科 副粘病毒科 披盖病毒科 疱疹病毒科 牛 人 马 牛 人 鼠疫病毒 慢病毒 水泡性病毒属 肝炎病毒 RNA RNA RNA 有 有 有 50至70 80至100 70×175 低 低 低 A型肝炎 RNA 无 25至30 高 副流感病毒 辛德毕斯病毒 假性狂犬病病毒 各类 人 猪 副粘液病毒 α病毒 水痘病毒 RNA RNA DNA 有 有 有 100至200 60至70 120至200 低 低 中 11
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注：本表给出了用于去除和/或灭活研究或者作为相关媒介的病毒的部分列表，即：源材料的有潜在污染的媒介，或作为模型媒介。因此，表中病毒的选用是非强制性的，并鼓励生产厂考虑采用其它的病毒，尤其考虑那些更适用于各个生产过程的病毒。
附录C
（资料性附录）
TSE因子去除和/或灭活研究指南
C.1 总则
TSE因子去除/灭活确认研究较难设计，操作和结果都难以解释。必须考虑携媒材料的性质极其与自然环境的相关性，考虑研究的设计（包括缩小过程的规模）和检测媒介的方法。还需对做进一步研究来理解确认研究中最适当的 “携媒制备”。因此，现在一般不要求确认研究。
除了适当的索源以外，还应鼓励生产商继续进行去除和灭活方法的研究，以确定步骤/过程有助于TSE因子的去除和灭活。无论如何，设计生产过程宜尽可能考虑被认为是灭活或去除TSE因子方法的有用信息。
对适当的确认研究，生产商宜在科学的基础上建立一个特定的灭活和/或去除研究，须考虑以下因素：
——涉及组织的已识别风险 ——相关媒介的识别；
——模型媒介具体组成选择的基本原理。
——所选传播媒介的去除和/或灭活的生产阶段的识别； ——计算降低系数
最终报告宜识别去除和/或灭活有效性的关键生产参数，对这些参数应明确和规定容许的范围。 宜使用适当的形成文件的程序以保证常规生产中应用已确认的过程参数。
在灭活确认研究中已使用或已推荐使用的传播媒介模型的实例是羊痒病菌株263K,139K,22C,ME7 87A和301V鼠传播BSE。
在模型TSE控制研究中，动物研究得出了某些量化方法。 C.2
还宜考虑一个阶段残存的媒介是否能抵抗下一个阶段，或换句话说已经增加了抵抗力。例如，已发现TSE因子经甲醛处理后增加了它们对热的抵抗力。通常，具有大作用的一个阶段比总作用相同的多个阶段更具有安全保证。
在一个过程阶段中TSE滴定度的降低小于1 log被认为可忽略不计。
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附录D
（资料性附录） 缩小规模的指南
由于将媒介引入生产场所具有危险性，因此去除和/或灭活研究的确认宜在配备用于病毒学研究的独立实验室中进行，并由具有专业技能的适宜人员操作。为便于操作，缩小过程的规模可能是必要的。如果使用小规模的过程，则可将以下部分作为指南：
a) 小规模的模型宜尽可能模拟生产过程，并宜联合对实际规模生产过程负责的生产人员一起进行设计；
b) 小规模过程每一相关步骤的有效性宜根据过程参数（如：pH值，浓度，体积，温度，设施，反应时间，成分）的比较形成文件；
c) 宜按照能代表去除和/或灭活病毒和传播媒介的有关生产过程能力的最差情况条件设计小规模过程；
注：宜对最差情况条件的确定给予特别注意。文献的评价或过程操作极限的实验会对这一活动有所帮助。
d) 宜验证实际规模生产过程不可避免的偏离对结果的潜在影响。 e) 基本原理，研究方案和小规模的可接受准则应形成文件。
附录E
（资料性附录）
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病毒滴定度和降低系数的统计评价及其有效性评定
病毒滴定面临所有生物分析系统所共有的各种问题。为了明确一项研究的可靠性，有必要对病毒滴定及由此而计算出的降系数的精度给予评定，对分析予以确认。统计学评价的目的是确定研究是否已进行到病毒学专业方面的可接受水平。
1.分析方法可以是计数法（quantal），也可是计量法(quantitative)。计数法包括动物上的感染性分析或组织培养感染剂量（TCID）分析，分析中动物或细胞培养被记为被感染或未感染,然后再用那些被感染的细菌培养物测量感染性滴定度。计量方法包括了色斑分析，即对每一个色斑按一个感染单位计数。计数法和计量法都可用统计分析。
2.由于稀释的错误、统计学的影响和分析系统中那些未知或难以控制的差异，导致分析结果的不一致。不同分析方法之间比对（分析内的变异）和同一方法间的比对（分析间的变异），表明前者的这些影响明显大于后者。
3.分析内的变异和分析间的变异的95%的置信限宜达到±0.5log10或更好。通过制备内部基准能监控分析间的变异，对这些能力的评估，宜在该分析试验室已建立的可接受平均估计值约0.5 log 10之内。可以通过标准教科书的方法评价分析内的变量。在任何具体试验中，如果滴定的精确度低于这些目标值，如经论证，该项研究可能还是可接受的。
4.宜通过实验测定的毒并滴定度计算出病毒负载的降低。宜尽可能获得降低系数的95%的置信限。
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该置信限可以用±（s+a）来近似，±s是原材料病毒分析的95%的置信限，±a是指步骤后的材料的病毒分析的该置信限。
如果在灭活/消除步骤后没有样品显示感染迹象，则降低系数就不能通过统计方式进行估计。要获取最小降低系数的估计，该滴定度应被表示为小于或等于被测试的最高浓度体积中的一个感染单元。尤其是在强灭活过程之后，样品会被期望无感染迹象。为了最大可能地估计出一个有效灭活过程的最小降低系数，宜尽量多地抽取处理过的未被稀释的材料。
宜对传播媒介的这些建议予以考虑。
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