安全空间，备有除了病人常规护理的材料外应具备手套、防护服和防护面具等，同时要装备有洗手的设施和装有消毒液的桶。
2.采集埃博拉出血热患者血样会给医护人员带来风险，应由经过生物安全防护培训的人员执行，采血时应2人在场。
3.采用分离胶无菌真空促凝管采集静脉血，每管3mL，采集后用封口膜封闭管口，标记清楚后放入自封袋或50mL离心管内，并在自封袋或离心管外表面再清楚标记，4℃保存，填写标本采集登记表。
4、留观病例和疑似病例应在发病3天后，采集静脉血4管，其中2管送指定的具有埃博拉出血热检测资质的实验室进行埃博拉病毒检测，2管保存于样本采集单位或所在省疾病预防控制机构，待排除埃博拉病毒感染后用于其他病原体的筛查。
5、确诊病例采集恢复期血标本，包括并不限于出院前标本2份，每份2管，采集时间间隔不少于48小时。
四、标本包装、运输。
（一）所有疑似埃博拉病毒相关感染性标本的运输应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《人间传染的病原微生物名录》等相关规定，采取A类包装，符合UN2814要求。按照三重包装系统包装：第一层包装为自封袋或50mL离心管；第二层包装为防水、防漏的安全壳容器；第三层为运输包装组成。封在防漏自封袋或离心管内的样本应首先放置在耐用、防水防漏的第二层安全壳容器中，用吸水纸等填充物将封好的标本固定好。安全壳容器和外包装须与IATA危险物品条例包装制度650相符合。
（二）写明标本的详细情况、运送者及预期接收者地址，并密封在塑料袋里，用胶布分别粘在外层容器里面和外面并留档以便追踪，方便实验室操作人员查对标本数量。
（三）样本运输之前，应按相关生物安全规定先和样本接收单位相关生物安全负责人联系，办理相关手续，运送日确定后即通知接收实验室标本运送的时间和运输方式。
五、样本保存和销毁
（一）实验室检测埃博拉病毒阳性血标本，应根据《病原微生物实验室生物安
全管理条例》等相关生物安全规定保存在-70℃以下，实行“双人双锁”管理和取样“审批”制度。
（二）实验室检测埃博拉病毒阴性血标本，应所采集疑似患者或密切接触者完全排除埃博拉病毒感染后，转入其他血清库保存或销毁。
（三）所有血清销毁时，均应在冰箱内取出后，在生物安全柜内，待其自然融化后，置于含有效消毒剂内浸泡，然后高压灭活。
（四）所有销毁样本均应在相应数据库清单内标明，销毁的时间和操作人，阴性样本灭活记录保存1年以后可以清除，阳性样本的销毁记录应保存5年以上。
附件2
埃博拉病毒核酸检测方法
1目的
埃博拉病毒核酸的提取及PCR检测。 2 适用范围
适用于检测血标本中埃博拉病毒核酸。 3 实验前准备
核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。 4检测仪器设备和材料
实时定量核酸扩增检测仪，常规核酸扩增检测仪，RNA提取试剂盒，一步法RT-PCR扩增试剂盒，一步法实时定量RT-PCR扩增试剂盒等。
5实验步骤 5.1实验准备
a.提取埃博拉病毒RNA要求在BSL-3级实验室内操作。
b.进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂，样品。预约实验场所。 5.2 RNA的提取
使用QIAampViral RNA Mini 试剂盒提取血清标本中病毒RNA（使用其他试剂盒或方法提取病毒RNA的应参照相应试剂盒说明书或实验室操作手册）。
a.吸取560μl包含载体RNA的AVL缓冲液(核酸提取裂解液)至1.5ml的 离心管中。 b.向上述的液体中加入140μl样品，脉冲涡旋式混匀15秒，室温孵育10分钟，简单离心使离心管顶端液体落到底部。
c.在样品中加入560μl 96－100％的乙醇，混匀15秒，再简单离心。 d.小心将630μl液体加入未浸湿的QIAamp小柱中，盖好盖，离心8000rpm/min 1min,弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上。
e.打开QIAamp小柱的盖子，重复步骤6，直至样品全部离心。
f.打开盖子，向柱中加入500μl AW1 缓冲液，盖好盖，离心8000rpm/min 1min，
弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上。
g.打开盖子，加入500μlAW2 缓冲液，盖好盖，离心 14，000rpm/min 3min。 将柱子置于一新的2ml收集管上，空离1min。
h.将柱子置于一新的1.5ml离心管上，加入50μl AVE洗脱缓冲液，室温孵育1min,离心8000rpm/min 1min。离心液即为病毒RNA，立即检测或-70℃以下保存。
5.3实时定量RT-PCR法分型检测埃博拉病毒核酸 5.3.1引物与探针 引物/探针 检测引物探针1
ZEBOV-F ZEBOV-R ZEBOV-P 检测引物探针2 EBOGP1D-fwd EBOGP1D-rev EBOGP1DZ-Prb
序列 CGCCGAGTCTCACTGAATCTG
AGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGT FAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1
TGGGCTGAAAAYTGCTACAATC CTTTGTGMACATASCGGCAC
FAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1
荧光标记
FAM/BHQ-1
FAM/BHQ-1
5.3.2 实时荧光定量RT-PCR扩增
实时荧光定量RT-PCR扩增反应配置体系：
RNA模板5μl，酶（25x）1μl，缓冲液12.5μl，引物（10uM）各1μl，探针（10uM）0.5μl，加水至总体积25μl。
推荐反应条件为50℃30min，95℃10min，95℃15s、60℃45s反应40个循环。 5.3.3 结果判断
以定量荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct<35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的埃博拉病毒核酸检测阳性。
5.3.4 意义
荧光定量PCR是一种灵敏、特异、低污染的病毒RNA检测方法，可以定性或定量检测标本中的埃博拉病毒。阳性具有确诊意义。
5.4一步法常规RT-PCR方法检测埃博拉病毒核酸
5.4.1 引物：引物序列见下表 引物
方法1 EBV-GPF 451-472 EBV-GPR 1024-1003
序列
5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’ 5’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’
片段大小
570bp
方法2
Filo-A Filo-B
ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT
ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG
414bp
Filo-A-nested GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGG Filo-B-nested ATAATAATCACTCACATGCATATAACA
282bp
5.4.2 PCR扩增
用引物对EBV-GPF和EBV-GPR、FiloA和FiloB进行PCR扩增。推荐反应条件为
94℃预变性2min，然后 94℃变性30秒，55℃退火30秒， 72℃延伸1分钟，反应
40循环，最后72℃延伸10分钟。如为套式PCR则开展第二轮扩增。
第二轮分型PCR扩增体系配置采用正向引物Filo-A-nested与反向引物
Filo-B-nested。推荐反应条件为 94℃预变性2min，然后 94℃变性30秒，55℃退火30
秒， 72℃延伸1分钟，反应30循环，最后72℃延伸10分钟。
6.4.3 1.5%浓度琼脂糖电泳分析。 6.4.4 结果判读
a，阳性：电泳显示相应大小DNA片段。 b，阴性：无特异性核酸片段扩增。 6.4.5 意义
阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染,需排除交叉污染。 7清场与消毒
7.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用0.5%次氯酸钠溶液和75%乙醇擦试外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。