缺点如下： 1）PCR-直接测序法
也称PCR-Sanger测序，该方法基于双脱氧核糖核酸（ddNTP）末端终止法，根据核苷酸在某一固定点开始延伸，随机在某一特定碱基处终止，由于掺入的每个碱基都进行了荧光标记，因此产生了以A、T、C、G结束的四组相差一个碱基的不同长度的系列核酸片段；通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。
PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测
序和结果分析四个主要步骤。分析时需要设置阴性对照和阳性质控品。该方法属于定性检测，优点是测序长度较长，可发现新的变异位点。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。
2）PCR-焦磷酸测序法
本方法是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。实验需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。所需试剂包括样本处理试剂、核酸扩增试剂、单链模板制备试剂、焦磷酸测序试剂和阳性质控品五大类。所需仪器为PCR仪和焦磷酸测序仪。为避免假阳性和假阴性结果，应严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止因试剂污染致假阳性发生。
该方法的主要优点：检测灵敏度较高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异。主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；检测灵敏度有限，对肿瘤组织中的低丰度体细胞突变（<3％）容易出现假阴性；测序长度仅10多个碱基，不能对长片段进行分析。 3）实时荧光PCR法
根据检测原理的不同，实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧
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光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。Taqman探针法同时综合了5’端核酸酶活性和荧光等技术，其在反应过程使用4条寡核苷酸链，其中两条为等位基因特异性探针，两条为PCR引物。两条探针可分别与突变型和野生型模板互补，其两端分别应用含报告基团和淬灭基团的染料进行标记，两条探针的报告基团荧光染料不一样。在进行SNP检测时，PCR扩增的退火过程导致探针与模板杂交结合，当引物延伸至探针处时，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将探针的5’端报告基团从探针上切除，使之与淬灭基团分离，从而释放出相对应的荧光，而没有配对的探针仍然保持完整而不会发荧光。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。
实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。目前CFDA已批准CYP2C9、VKORC1等多种基因多态性检测的PCR-荧光检测试剂盒。 4）PCR-基因芯片法
该方法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。基因芯片分型法的操作过程包括PCR核酸扩增、杂交、芯片扫描和结果分析。该方法用于DNA基因分型时属于定性检测，灵敏度为50 ng/μL。基因芯片法分析时需设置阴性对照和阳性质控品。应用基因芯片检测试剂盒时应确保试剂在开封前按要求保存、各组分液体使用前振荡混匀，杂交和洗片操作务必在避光条件下进行，PCR反应液和定位参照需避光保存，芯片加样时注意使液体铺满整个反应区，但不能溢出、不能出现气泡，以防交叉污染。其主要优点是可同时对多个待测SNP位点进行检测。我国CFDA已批准多种用于药物代谢酶和药物作用靶点基因如ALDH2、CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADR1、ACE、VKORC1多态性检测的基因芯片试剂盒。 5）PCR-电泳分析
该方法是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型。该方法属于定性检测，且只能用于对已知的多态性位点进行检测，不能识别未知多态性。琼脂糖电泳
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法适用于对片段较长的插入缺失多态性进行检测，如ACE插入缺失多态性；毛细管电泳法适于对较短的插入缺失多态性如UGT1A1*28多态性和微卫星不稳定性（MSI）进行检测。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子量标记物进行片段大小的判断。当分子量标记物反应管无条带或出现较弱的条带时，可能的原因包括点样孔漏、荧光染料不够或失效、电泳时间过长或电压过大。该方法的优点是成本低，在普通实验室即可开展；缺点是只适合对DNA插入/缺失多态性或融合基因进行定性测定，不能用于SNP的检测。 6）PCR-高分辨率熔解曲线（HRM）法
该方法通过对PCR反应的熔解曲线分析进行基因分型。PCR扩增的熔解曲线取决于其扩增序列，序列中一个碱基的差异都可导致双链DNA的解链温度发生变化。HRM法应用实时荧光定量PCR仪监测这种细微的温度变化，确定所扩增的目的片段中是否存在突变，从而用于基因分型。HRM分析使用LC Green等饱和荧光染料，该类染料在饱和浓度时对PCR反应无抑制作用，因此可以高浓度使用，从而全部结合DNA双螺旋结构中的小沟。在双链DNA的变性过程不存在荧光分子的重排，其特异度得到大幅提升，因此，熔解曲线细微的变化可以反映扩增片段中碱基的差异。应用本方法进行基因分型属于定性分析。
该方法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确，有利于实现闭管操作，在进行甲基化检测时可根据熔解曲线确定甲基化程度的高低。该方法的缺点是：不能排除待测核酸中新出现的遗传变异；由于单个碱基突变导致DNA解链温度的变化非常小，该方法对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。
7）等位基因特异性PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）
又称为扩增阻滞突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR）。该技术的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端错配的碱基会导致引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。因此，AS-PCR反应需要两条等位基因特异的引物和一条共用的反向引物，两条非特异性引物在3’端与模板错配，但其他部分碱基序列完全一样。只有引物的3’端与模板完全配对时，PCR扩增才可以进行。PCR产物可通过凝胶电泳进行分析和基因型的判断。该方法也可与实时荧光定量PCR结合起来进行基因分型。该方法可以用于检测
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各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测；缺点是假阳性率较高。
8）PCR-限制性片段长度多态性方法
限制性片段长度多态性方法（RFLP）是一种基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列和结构DNA，并对其进行剪切的原理。限制性内切酶通常识别双链DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近将双链DNA切断，从而产生较短的DNA片段。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化都可以导致酶切活性的消失。利用这一特性，若待分型的SNP位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种等位基因具有酶切活性。因此，对位于限制性酶切识别位点的SNP进行分型时，可以使用包含该位点的PCR产物与相应的限制性内切酶进行温育。酶切以后的产物进行电泳，并根据酶切产物片段的大小来进行基因分型。该方法不需要任何探针，也不需要特别的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强。但缺点也很明显，主要是通量太低，大量分型时工作量大，并且只适用于部分SNP分型。 9）原位杂交（ISH）法
ISH法以各种人体标本，包括相应实验方法制备的细胞学和组织学标本（福尔马林固定石蜡包埋）作为靶标，采用目的DNA探针与该靶标进行分子杂交，从而检测相关的靶基因异常。ISH技术按照探针标记物的类型，可分为亮视野原位杂交和荧光原位杂交（FISH）。ISH法检测的靶标具有完整的细胞核，无需进行核酸的提取。其具体的方法学原理见《原位杂交（ISH）指南》。在药物代谢酶和靶点基因检测中，ISH法主要用于测定基因扩增和基因缺失异常。
表1. 各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较 方 法 AS-PCR
优 点
缺 点
适用性
对小样本、低突变比例的体细胞突变进行检测。
灵敏度高，适于对通量低 肿瘤组织中突变比例较低的体细胞突变进行检测。
实时荧光PCR 通量较高，操作简探针较昂贵
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对相同位点、大样本标本
单，仪器设备易普及。
焦磷酸测序
进行检测，可用于mRNA表达检测。
高通量，高灵敏需要特殊仪器设适合于较大样本、突变比度，可以检测插入备。 /缺失突变和未知突变。等位基因含量的比例可用于室内质控。
例高于5％的各种类型SNP检测、甲基化位点的确定。
HRM 成本低，灵敏度需要特殊仪器设适合有该类机器的实验室高，闭管操作，降备，条件摸索过程开展各种类型SNP分型研低污染风险。
较为困难
究；可用于已知甲基化位点的检测。
Sanger法测序 直接获取序列，分通量低，不能检测各种SNP的检测，未知突型的金标准，可发突变比例小于变的筛查以及验证其他分现未知突变。
20％的SNP。
型的结果。
PCR-RFLP 无需特殊的仪器通量低，只适用于适用于无条件够买贵重仪设备，成本较低，部分SNP分型 实验过程简单，可操作性强。
器设备的实验室开展小样本的分型检测。
基因芯片法 通量高 灵活度低，成本适用于具备芯片检测能力高，需要特殊的仪的实验室对已知固定位器设备。
点、大样本标本进行检测。
原位杂交（ISH）
在细胞核原位对成本高，通量低，适于对基因扩增和缺失异基因的异常进行时间较长。 检测
常进行检测。
5.2.3 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测项目及类型
遗传药理学知识库（PharmGKB）根据项目成熟程度将个体化用药基因检测项目分为4级，并认为其中1级项目（包括1A级和1B级）满足临床应用的最高标准，而4级项目适于临床应用的证据最少[1]。1A级项目为同时获临床遗传药理学实施联盟
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