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无葡萄糖，有阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与
操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。
? 没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖，因为没有诱导物，尽管有cAMP-CAP与操
纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B位点相结合，无araBAD mRNA转录。
? 无葡萄糖，有阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与
操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CAP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。
（3）ara操纵子的调控有三个特点： ? 第一，araC表达受到AraC的自动调控。 ? 第二，AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂。 ? 第三，AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子。
三、真核生物基因表达的调控
（一）真核生物表达调控的特点
1. 多层次调控（5个水平）； 2. 顺式作用元件/反式作用因子的转录调节模式； 3. 基因表达以正调控为主； 4. 细胞特异性/组织特异性表达； 5. 转录与翻译在不同的区域进行； 6. 无操纵子和衰减子； 7. 个体发育复杂； 8. 受环境影响较小。 ★ 真核生物的调控也主要发生在转录水平上 ? 顺式作用元件（cis-acting element） ? 定义：真核生物中对自身基因表达有调节活性的DNA序列。
包含启动子、增强子、沉默子和绝缘子等类型；通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。
? 反式作用因子（trans-acting factor） ? 定义：指真核生物中一类可通过与特异的顺式作用元件相互
作用，使邻近基因开放开放或关闭，即对转录起促进或阻遏作用的蛋白质因子，也称转录因子
（二）DNA和染色体水平调控
1、DNA的甲基化 2、组蛋白的修饰
3、染色质的结构变化 4、基因丢失和基因扩增 5、基因重排
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（三）转录水平上的调控
真核生物的调控也主要发生在转录水平上：
顺式作用元件（cis-acting element）；反式作用因子（trans-acting factor），转录调控是通过两者的相互作用来实现的。 1、顺式作用元件的分类
启动子；增强子；沉默子；绝缘子；转座子；其他应答元件 。
启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列位于基因的上游RNA聚合酶通过与它的结合而启动基因的转录 增强子(enhancer)：能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，顺式作
用元件（DNA序列）。
沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。 绝缘子(Insulator)：一种负调控元件，参与基因表达的负调控。 ? 阻止基因表达调控的传递（激活或阻遏），其作用可不受序列方向影响，能远距离发挥作用。
转座子（transposon）：能将自己插入基因组中新的位置的DNA序列。 2、反式作用因子(trans-acting factor) 包括：转录因子、RNA聚合酶、调控蛋白等。 ★ 反式作用因子的调控作用： ① 蛋白质和DNA相互作用； ② 蛋白质和配基结合； ③ 蛋白质之间的相互作用; ④ 蛋白质的修饰。 （四）真核基因表达的转录后水平调控
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mRNA前体：hnRNA 加工：加帽、加尾、剪接、修饰和编辑等过程
5′端加帽(cap)和3′端多聚腺苷酸化(polyA)的调控意义
使mRNA稳定，在转录过程中不被降解
mRNA的选择剪接 外显子选择、内含子选择、互斥外显子、内部剪接位点 产生不同mRNA，翻译出不同的肽链
mRNA 运输的控制
（五）真核基因表达的翻译水平调控
1、5’UTR结构与翻译起始点调节
2、蛋白质磷酸化对翻译效率的影响（起始因子的磷酸化） 3、3’UTR结构与mRNA稳定性调控
（六）真核基因表达的蛋白质加工水平调控（翻译后水平）
1、新生肽链的水解：酶解
肽链N端的第一个氨基酸：稳定化氨基酸（Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、
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Gly、Pro）与去稳定氨基酸
2、肽链中氨基酸的共价修饰：磷酸化、甲基化、酰基化 3、通过信号肽(signal peptide)分拣、运输、定位
第五章 基因重组与基因工程
一、基因重组
（一）基因重组和相关概念
1、基因重组：是指不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而成新组合的DNA
分子的过程。
2、基因重组技术：是指采用酶学方法将不同来源的DNA按照人们的设计方案在体外切割与连接，拼装组合成新的杂合DNA分子的技术。 （二）基因重组的分类
1、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本
重组。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列
间进行单链或双链片段的交换。
重组酶：RecA蛋白等 2、细菌的基因转移与重组 （1）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移
至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。
（2）转化作用
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表
型，称为转化作用 (transformation)。
（3）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用 (transduction)。以病毒等为媒介的DNA转移与重组。
3、位点特异重组
位点特异重组(site-specific recom-bination) 是由整合酶催化，在两个DNA
序列的特异位点间发生的整合。
（1）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合； 反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long
terminal repeat, LTR)。
（2）细菌的特异位点重组
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
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（3）免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。 （4）转座重组
由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 ① 插入序列转座
插入序列(insertion sequences, IS)组成： 二个反向重复序列(inverted repeats, IR) 侧翼的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因 ② 转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
二、基因工程
（一）相关概念 1、克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 2、基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工
作，又称重组DNA技术。
3、工具酶 （1）限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸
内切酶，简称限制酶或切割酶。
特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断
回文序列(palindrome)：是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复 ★ 限制酶识别及切割位点：
主要产生3种末端结构：5ˊ－粘性末端；3ˊ－粘性末端；平端或钝端。 粘性末端(sticky end)：是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3
ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。
★ 同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。
在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；
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切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。
（2）DNA聚合酶 4、载体
（1）载体(vector)：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送
到宿主细胞的运载工具。 其化学本质为DNA分子 。
（2）常用载体：质粒DNA；噬菌体DNA；病毒DNA。 （3）载体必须具备的基本条件：
具有独立复制能力；具有遗传表型或筛选标记；有足够的容量以容纳外源DNA片段；可导入受体细胞；具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)。 （4）载体的分类
① 克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体，即用来克隆和扩增DNA片段的载体。
有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。
② 表达型载体：为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。
5、目的基因
（1）目的基因的获取
① 人工（化学）合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 ② 基因组DNA文库(genomic DNA library)；③cDNA文库(cDNA library)； ④ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。 （2）基因组DNA文库
存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 （3）聚合酶链反应（PCR）
在体外，以含目的基因DNA为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNA Pol等存在下，构成一个反应体系。经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（25?30次），扩增目的基因。
（二）基因工程的基本步骤和原理
1、目的基因的制备； 2、基因载体的选择；
3、目的基因和载体的剪切； 4、目的基因与载体的连接；
5、宿主细胞的转化（重组DNA分子导入宿主细胞，从而获得新的遗传特性）； （1）受体菌条件：安全；处于感受态(competent)
用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞
（2）导入方式：转化 (transformation)；转染 (transfection)；感染
(infection)，转导。
6、重组体的筛选和鉴定 （1）插入失活
当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上 （2）蓝-白筛选（重点！！！）（看书165）
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
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