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（3）标志补救
（4）分子杂交法: 原位杂交; Southern印迹 7、克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化 ★ 克隆基因表达的条件：
? 基因的编码区不能被插入序列中断;
? 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞RNA聚合酶有效地识别; ? mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细
胞的蛋白酶所降解。
三、基因工程技术在医学中的应用
（一）基因诊断
? 分离、扩增待测的DNA片断；分或鉴定DNA的异常 产前诊断；携带者测试；症候前诊断；遗传病易感性
（二）基因治疗
1、定义:有功能缺陷的细胞，补充相应功能的基因以纠正或补偿其基因的缺陷。 2、方式：体细胞基因治疗；性细胞基因治疗 （三）基因工程疫苗
利用基因工程方法表达出病原微生物一段基因序列，将表达的产物（多数无毒、无感染性、免疫性强）作为疫苗。
（四）基因工程制药 （五）转基因动物 转基因动物：是指人类按照自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内，通过与染色体基因组进行稳定的整合，将生物性状传递给后代动物。
第六章 疾病的分子生物学
一、基因与疾病
基因突变:由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺
序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结构；其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。
（一）基因突变的诱发因素和分子机制
1、物理致癌：如电磁波、放射性同位素、紫外线等 2、化学致癌
（1）直接致癌物：烷化剂、亚硝酰胺类
（2）间接致癌物：多环芳烃类 烤制、熏制鱼类，亚硝胺类 油煎食品，酸菜
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3、病毒致癌
（1）DNA病毒
（2）RNA病毒—逆转录病毒
（二）基因突变的类型与后果
1、突变类型 （1）点突变: 是单个碱基的改变；转换 （transition）& 颠换 （transversion） （2）缺失: 是一个或多个核苷酸的丢失 （3）插入: 是一个或多个核苷酸的增加 （4）倒位: 是一段核苷酸序列方向倒转 2、突变的后果
（1）编码序列中遗传密码的改变
① 错义突变：指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。
② 无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变
③ 同义突变：密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变
④ 移码突变：指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基（但不是三联体密码子及其倍数），在读码时，由于原来的密码子移位，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。
（2）非编码序列的突变
剪切错误；启动子/终止子区域序列改变；“帽子/尾”的变化
二、肿瘤分子生物学 肿瘤：是由于细胞的增殖与分化失常所导致的细胞或组织恶性生长的现象
（一）肿瘤的细胞生物学特征
肿瘤细胞的基本特征 细胞失去控制，恶性增殖；细胞分化障碍；细胞凋亡受阻；与周邻细胞关系改变，发生侵袭和转移。
（二）癌基因Oncogenes
1、正常细胞内以及致癌病毒体内所固有的；控制细胞生长和分化的基因；它的结构异常或表达异常，能引起细胞恶性转化（癌变）的基因。
2、癌基因是正常细胞编码关键性调控蛋白的基因，是细胞内正常基因。 因此习惯上将RNA肿瘤病毒中所含的致癌基因称为病毒癌基因（V-onc）。 而将生物正常细胞基因中的癌基因称为细胞癌基因（C-onc）或称为原癌基因。 3、癌基因家族
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（1）src家族（酪氨酸蛋白激酶）
? 定位： c-src，20号染色体，17个外显子。 ? 编码： 60kDa,具酪氨酸蛋白激酶（TPK)活性。
? 作用：与细胞无限生长关系密切；通过激酶的磷酸化作用，改变对底物的活性；加速生长信号在胞内的传递。 （2）ras家族
成员：H-ras病毒、K-ras病毒、N-ras神经母细胞瘤 编码：4个外显子组成， 蛋白质为21Kd
特点：编码的氨基酸顺序有85％的同源性，主要 位于细胞膜的内侧面，属G蛋白
作用：参与细胞增殖信号的细胞内转导过程，是维 持细胞生长和分化的重要信号转换器。 （3）myc家族 myb家族
数量：c-myc,N-myc、L-myc、R-myc
编码：3个外显子组成，Exon1不编码，缺少ATG，但多个终止密码子；另外两个外显子表达62-64kDa或66-67kDa的蛋白 特点：位于核内，属于DNA结合蛋白类，与DNA复制起动有关 4、功能
调节细胞生长与增殖；调节细胞分化有些癌基因的产物参与基因表达的调控。
（三）抑癌基因（tumor suppressor gene）
抑癌基因(suppresser gene)又称抗癌基因(anti-onc)是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。 抑癌基因及其表达产物 抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反。
（四）癌基因与抑癌基因的致癌协同作用
1、多步致癌学说（肿瘤瘤发生学说） 2、多种致癌因素综合作用的结果 物理因素(如紫外线、电离辐射等)；化学因素(如黄曲霉毒素)；生物因素(DNA或RNA致癌病毒) 3、多阶段变化便形成了肿瘤 启动阶段；发展阶段（促癌阶段）；转移扩散阶段（转化阶段）； 癌基因激活：点突变、插入启动子/增强子、基因重排、基因扩增； 抑癌基因失活：突变/缺失，磷酸化状态异常，癌基因产物的抑制作用。
三、遗传性疾病的分子生物学
（一）概念
由于生殖细胞或受精卵的遗传物质在结构和功能上发生了改变，而导致后代个体所患的疾病称为遗传病。
（二）分类
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1．单基因病: 由单个基因或一对等位基因的缺陷或突变引起。
如：软骨发育不全，苯丙酮尿症
2.多因子疾病: 受多对基因控制并易受环境因素影响的疾病。 如：高遗传度（唇腭裂），低遗传度（冠心 病、肿瘤） 3.染色体病：数目异常、结构异常 。如：21三体综合征
（三）特征
1、垂直传递即世代之间遗传，上代传下代； 2、遗传物质突变，包括染色体畸变； 3、突变发生在生殖细胞或受精卵； 4、疾病终身表现。
第八章 常用分子生物学技术 一、核酸分子杂交技术
（一）核酸探针(probe)
1、标记的DNA或RNA，一小段用同位素、生物素或其他活性物质标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，能与靶序列互补结合，从而判断是否有同源的核酸分子存在。
2、来源与性质分类
cDNA探针；基因组DNA探针；核苷酸探针；NA探针 （二）核酸分子杂交技术
应用核酸分子双链结构以及核酸双链结构的变性和复性的性质，使来源不同的DNA或RNA片段按碱基互补关系形成杂化双链分子的过程。
（三）核酸分子杂交的分类 1、液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应； 2、固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。
（1）常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等 （2）常用固相核酸杂交方法
Southern 印迹杂交法（Southern blotting ）；Northern 印迹杂交法（Northern blotting ）；斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization）；菌落杂交（colony hybridization）；夹心杂交法（sanwich hybridization）；原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
二、DNA序列测定
（一）DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
1、原料：单链模板DNA；引物；DNA聚合酶Ⅰ； 底物：dATP、 dGTP、 dCTP、dTTP、ddNTP 2、基本原理（课本231）
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（二）化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理：基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断
裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。
分析前，用同位素标记DNA的5′末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
三、聚合酶链反应（PCR技术）（重点！！！）
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量扩增。
（一）PCR定义/原理
1、引物；反应体系；高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期使模板以几何级扩增 2、PCR特点
快速、特异、灵敏、简便。可用于极微量， 甚至单个DNA模板的体外分子克隆 3、PCR体系基本组成 （1）模板DNA
PCR模板可以是DNA或RNA。
以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102?105个拷贝； （2）特异性引物
引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15?30个碱基。 ★ 设计引物的原则：
? 二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 ? 长度为18 ~ 25个核苷酸
? 二条引物之间避免形成引物二聚体 ? 引物的碱基组成应平衡
? 引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）
? 引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） （3）耐热DNA聚合酶（Taq酶）
（4）底物dNTPs：PCR一般用50?200μmol/L的dNTP；且4种dNTP浓度应相等 （5）Mg2+：PCR技术常用10?50mmol/L Tris-HCl、Ph8.3?8.88、偏碱缓冲液；
并含有一定量的Mg2+浓度。
（6）参数
① 变性温度与时间：一般选择94摄氏度，30秒 ② 退火温度与时间
取决于引物长度、浓度 和G+C含量，一般选择： Tm - 5℃ ③ 延伸温度与时间：一般选择70℃ ?75℃
④ 循环次数：取决于模板浓度，一般循环30～35次
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