细胞生物学实验
教案
实验一：特殊显微镜的使用及显微摄影术
一、实验目的：
1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜的原理、构造及其使用方法。2、掌握显微摄影装置及其操作技术，独立完成显微摄影全过程。 二、实验原理：
暗视野显微镜应用丁达尔现象，装配暗示场聚光器，是入射光从聚光器斜向照明被检样品。暗视野显微镜利用样品的散射光和放射光进行观察，只能观察物体的存在与运动而不能辨清其细微结构。暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不能进入物镜，使视场背景暗黑，样品明亮的照明方法。
相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，通过衍射和干涉现象，将肉眼看不到的相差，变为明暗的振幅差而能看到。相差显微镜应用于生物学的主要价值，在于对透明的活体进行直接观察，无需采用是细胞致死的固定和染色的方法。
0lympus BH系列的BHS和BHT型显微镜有摄影装置，通过摄影装置，拍摄显微视场中被检样品。 三、实验仪器与试剂
1、材料：洋葱鳞茎、人口腔细胞；
2、器材：暗视场显微镜、相差显微镜、Olympus显微镜、活体生物样品、
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擦镜纸、消毒牙签、镊子、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片
3、试剂：生理盐水（0.9%）、2%碘液、香柏油、二甲苯。 四、实验步骤与方法
（一）口腔上皮细胞的制备及染色
1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；
2、用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水；
3、用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁轻轻地刮几下； 4、把牙签上的碎屑放在生理盐水中轻涮几下； 5、盖上盖玻片；
6、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液； 7、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。 （二）洋葱鳞茎内表皮装片制作
1、把载玻片和盖玻片擦拭干净； 2、用滴管在载玻片的中央滴一滴蒸馏水； 3、用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮置于蒸馏水中； 4、盖上盖玻片；
5、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液； 6、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。 （三）分别用暗视场显微镜和相差显微镜观察 （四）显微摄影的使用
将装片置于显微摄影镜下,选一清晰的视野进行拍摄并打印出来。 作 业：交一张显微摄影相片，并贴在实验报告上。
思考题：为什么暗视场照明的视场暗黑，而样品像明亮？相差显微镜镜检时，为什么要用绿色滤色镜观察活体样本？
实验二：类坏死细胞的处理及死活细胞鉴别
一、实验目的：
1、学习并掌握细胞计数原理及方法；2、学习并掌握类坏死细胞的处理方法；3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
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二、实验原理：
1、类坏死细胞是细胞介于生活和死亡之间的临界状态。引起类坏死的方法多种多样，如高温、冷冻、紫外线照射、酸碱处理等。类坏死和死亡之间的区别在于前者发生的变化是可逆的，而后者是不可逆的。
2、血球计数板是用以计数红细胞和白细胞的。四个边角大方格，都用以计数白细胞的，而正中间的大方格则是用以计数红细胞的。
3、死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是许多酸性染料不易穿过活细胞的质膜进入细胞内，却能进入死亡的细胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
三、实验器材与试剂： 1、材料：鸡血细胞。
2、实验器材：显微镜、血细胞计数板、水浴锅。
3、试剂：5%柠檬酸钠、1%台盼蓝溶液（生理盐水配置）、Ringer液、HanK液、0.1mol/L CH3COOH（HanK液配制）、0.001 mol/LNH3（Ringer液配制）、 四、实验步骤与方法：
（一）类坏死细胞的处理。 1、碱处理：
A、取5支试管编号，分别加入1 ml鸡血细胞悬液；
B、分别加入1 ml0.001 mol/LNH3混匀，37℃培养1、5、10、20、30min。 C、加入5 ml Ringer液离心（800~1500r/min ）5min去上清液，重复2次，再加入1 ml Ringer液。
2、酸处理：
A、取5支试管编号，分别加入1 ml鸡血细胞悬液；
B、分别加入0.05、0.10 、0.15、 0.20 、0.40 ml 0.1mol/LCH3COOH混匀，37℃培养10 min。
C、加入5 ml HanK液离心（800~1500r/min ）5min去上清液，重复2次，再加入1 ml HanK液。
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（二）染色制片：
取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml（1~2滴）染液，混匀，2min后立刻加入血细胞计数室，镜检计数。
（三）观察结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。根据下式求细胞活力： 细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）÷细胞总数×100% 作业：书写实验报告，计算所测细胞成活率。
思考题：为什么活细胞不易染色，从细胞生物学角度解释原因。 附：HanK液的配制：
HanK原液：NaCl 80.0g; Na2HPO4.2H2O 0.6g; KCl 4.0g;KH2PO4 0.6g; MgSO4.7H2O 2.0g; 葡萄糖 10.0g; CaCl2(无水) 1.4g;加水至1000ml.并加入防腐剂（氯仿或双抗）
配制程序：①称取CaCl2(无水) 1.4g，溶于30~50 ml. 重蒸水中。②取1000ml.烧杯及容量瓶各1个，先放入800 ml. 重蒸水于.烧杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。但必需在前一药品完全溶解后，方可是加入下药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，加时要边加边混匀，注意不要出现沉淀。最后用容量瓶定容至1000ml.并加入防腐剂（氯仿2 ml.）充分混匀分装并盖紧瓶塞，于4℃下保存。
HanK液的配制：HanK原液100ml；重蒸896 ml；0.5%酚红4 ml。经5.28×104Pa(8磅)灭菌30min,置4℃保存。使用时加入NaHCO3少许调至所需的PH。
NaCL 8.00g；KCL 0.40g；CaCL2 0.14g；MgSO4.7H20 0.20g；Na2HP04.H2O 0.06g；KH2PO4 0.06g；NaHCO3 0.35g；葡萄糖 1.00g；酚红 0.02g；加水至1L，用NaHCO3调PH至7.2~7.4
Ringer溶液：NaCl 8.5g(变温动物6.5g);CaCl2 0.12g; NaHCO3 0.20g; KCl 0.14g; Na2HPO4 0.01g; 葡萄糖 2.0 g ；加蒸馏水至1000ml
实验三：线粒体和液泡系的超活染色与观察
一、实验目的：
1、观察动、植物活体线粒体、液泡系的形态、数量、分布；2、学习一些细
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胞器的超活染色技术。 二、实验原理：
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染色溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某些结构上而染色。碱性染料的胶体表面带阳离子，酸性染料的胶体表面带有阴离子，而细胞被染的部分本身是具有阴离子或阳离子，这样就发生吸引作用。Janus green B和neutral red 二种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
Janus green B活体细胞染色的机理：Janus green B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
Neutral red 碱性染料活体染色的机理：neutral red为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中某些蛋白质有关。 三、实验器材与试剂
1、材料：人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
2、器材：显微镜、恒温水浴锅、解剖刀、镊子、盖载玻片、吸管、牙签等
3、试剂：Ringer溶液：NaCl 8.5g(变温动物6.5g);CaCl2 0.12g; NaHCO3 0.20g; KCl 0.14g; Na2HPO4 0.01g; 葡萄糖 2.0 g； 加蒸馏水至1000ml
1%、1/3000中性红（neutral red）溶液：称取0.5g中性红溶于50 ml Ringer溶液,稍加热(30~40℃)使之很快溶解,用滤纸过滤,即为1%原液。装入棕色瓶于暗处保存备用。 临用前，取1%原液1 ml，加入29 ml Ringer溶液混匀，即为1/3000中性红溶液，装入棕色瓶。
1%、1/5000詹纳斯绿B（Janus green B）溶液：1%詹纳斯绿B溶液的配制：称取0.5g Janus green B溶于50 ml Ringer溶液,稍加热(30~40℃)使之很快溶解,用滤纸过滤,即为1%原液。装入棕色瓶备用。
1/5000詹纳斯绿B溶液的配制：临用前，取1%原液1 ml，加入49 ml Ringer溶液混匀，即为1/5000中性红溶液，装入棕色瓶。 四、实验步骤与方法：
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