四、实验步骤与方法
1、将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1mol/L HCl中，加热到60℃水解8~10分钟。
2、蒸馏水水洗。
3、Schiff 试剂遮光染色30分钟。
4、用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1分钟。 5、水洗5分钟。
6、将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱鳞茎表皮省去压片）
7、显微镜检查。细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性的反应。 *对照片
方法一：先将材料放在5%三氯乙酸中90℃水浴15分钟，主要把DNA抽提掉，然后按（1）~（7）制片观察。
方法二：材料不经水解，直接按（3）~（7）制片观察。
作业：绘图示洋葱根尖或鳞茎内表皮细胞DNA的分布部位。 思考题：简述Fenulgen反应的原理的实验的关键步骤。
实验六 细胞核与线粒体的分级分离（一）
一、实验目的：
1.对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
2.掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法 二、实验原理
利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。（差速离心技术）
线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它
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内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细胞的死亡。
Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。 三、实验器材与试剂
1、材料： 鼠肝脏, 猪肝脏
2、器材：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。
3、试剂：
（1）0．9%生理盐水。
（2）0.25mol/L 蔗糖-0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）（匀浆液）。 配法：0.1mol/L Tris 10ml ； 0.1mol/L盐酸 8.4ml ；加双蒸水到100ml。再向上述缓冲溶液中加蔗糖，使浓度为0.25mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖。
（3）1%甲苯胺蓝溶液。
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（4）0．02%詹纳斯绿B溶液。
四、实验步骤与方法 （一）细胞核的分离提取
1、实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中剪剪成小块（去除结缔组织），迅速用冰泠的生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水。
2、剪碎的肝组织移入玻璃匀浆管中，加入适量匀浆液，进行匀浆（注意保持冰浴状态），快速匀浆20~30次后，用匀浆液预湿的尼龙布过滤于离心管中。
3、离心（2500g，4℃下）15分钟，取上清液移入高速离心管中，并保存 于冰浴 中，待分离线粒体用。
4、收集的沉淀了少量匀浆液重新悬浮，以2500g离心15分钟，弃上清液。 5、加入少量匀浆液轻轻摇匀，然后制作涂片，自然干燥。 6、用1%甲苯胺蓝染色观察。 （二）差速离心分离线粒体
1、将预留的上清液以17000g4℃下离心20分钟，弃上清液。
2、加入匀浆液1ml，用吸管吹打数次，以17000g4℃下离心20分钟，将上清液吸入另一试管中，沉淀另入少量匀浆液制成悬液。
3、分别用上清液和沉淀制作涂片，用0．02%詹纳斯绿B溶液染色20分钟进行镜检（不另盖玻片）。 注意事项：
1、动物实验前必须空腹过夜，以降低肝脏中的脂肪含量。
2、实验过程中必须注意避免过于剧烈的机械操作，以保持细胞器的完整性。 3、由于核沉淀中可能依然存在大量的线粒体，故可将（4）的上清液与（3）的上清液合并保存。
4、线粒体是进行活性染色，故应尽快染色观察。 作业：绘观察到的细胞核的线粒体图。 思考题：试述差速离心法分离细胞器的原理。
实验六 叶绿体的密度梯度离心与荧光观察（二）
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一、实验目的：
1. 掌握叶绿体的密度梯度离心技术。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用方法。 3. 观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解。 二、实验原理
采用两种浓度有蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，此法可粗分或富集叶绿体。
叶绿体受激发光照射后可直接发出火红色荧光，称为自发荧光（直接荧光），叶绿体吸附荧光染料吖啶橙后发出桔红色荧光，称为次生荧光（间接荧光）。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，会受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此，在荧光观察时应抓紧时间立即观察和拍照。另外，在制作荧光显微镜标本时，最好使用无荧光载玻片和盖片。 三、实验器材与试剂
1、材料：新鲜菠菜或其它植物叶片
2、器材：高速离心机、组织捣碎机或研钵、天平、光学显微镜、、尼龙布、剪刀、载玻片和盖片等。
3、试剂
匀浆介质（0.25mol/L蔗糖，0.05mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4）:称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800 mL蒸馏水中，加入约4.25mL0.1mol/LHCl,最后蒸馏水定容至1000mL。
50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.01%吖啶橙，0.35mol/L NaCl 四、实验步骤与方法
1、 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称2~3g 。 2、加入预冷至0℃的匀浆介质10mL,利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min或冰上研钵研磨。
3、将匀浆液用200 目尼龙网或6 层纱布过滤，收集于离心管中。 4、500 r/min 下离心10min。
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5、在1.5 mL离心管内依次加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液各0.4mL,先加入50%蔗糖溶液，尔后沿管壁缓慢注入15%蔗糖溶液，不能搅动50%蔗糖液面。
6、用移液枪小心取（4）的上清液0.4mL沿管壁缓慢加入到 （5）中。 7、8000 r/min 下离心10min。
8、取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带 9、取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片。
（1）在普通光镜下观察。（2）在荧光显微镜下观察自发荧光。 10、在荧光显微镜下观察次生荧光。
取一滴叶绿体悬液在无荧光载片上，再滴加一滴0.01% 吖啶橙染液染色1min，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发出绿色荧光。
11、组织中叶绿体的观察
取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。 观察结果
1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2. 表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈无色。 3. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。
4. 叶脉导管呈螺纹状。
5. 保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。
6. 气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。 作业：拍摄像片。
思考题：试述密度梯度离心法分离细胞器的原理。
实验七：小鼠腹腔巨噬细胞的制备和功能的研究
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