（一）人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察 1、在载玻片滴2滴1/5000詹纳斯绿B溶液
2、刮取口腔上皮防入载玻片的染液滴中，染色5~10min，盖上盖玻片，置显微镜下观察
3、观察口腔上皮细胞及线粒体 （二 ）洋葱鳞茎内表皮细胞观察液泡
1、用吸管吸取1/3000中性红染液，滴一滴于干净的盖玻片上，撕取一片洋葱鳞片内表皮，置于染液中染色10~15min
2、用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，盖上盖玻片进行观察。 3、仔细观察液泡的颜色及位置。
作 业：绘制口腔上皮细胞线粒体形态与分布。
绘制洋葱鳞茎内表皮细胞，示液泡系形态与分布。
思考题：简述中性红染液、詹纳斯绿B染液用于细胞超活染色的原理。
实验四 细胞骨架的光学显微镜观察
一、实验目的：
1、掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法，观察光学显微镜下植物细胞骨架的网状结构。
2、通过考马斯亮蓝染色法观察微丝实验，初步掌握考马斯亮蓝染色法技术。 二、实验原理：
考马斯亮蓝染色法观察微丝考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基（Arg）或芳香族氨基酸残基结合，使蛋白变蓝。由于反应时颜色的深浅与蛋白的含量相关，所以可依此进行蛋白浓度的测定。考马斯亮蓝主要用于对蛋白含量的测定和对蛋白进行染色观察，在蛋白的定量分析、蛋白的电泳和细胞骨架观察中有非常重要的应用。由于考马斯亮蓝R-250并非微丝专一性的染料，所以，在用它对微丝进行染色观察前，应首先用去垢剂抽提掉胞质中的除骨架以外的其他蛋白，以便清
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晰地显示细胞质中微丝的结构。
本实验观察的是植物细胞中由微丝平行排列形成的微丝束，在动物细胞中称为“应力纤维”。非肌细胞中的微丝是动态结构，单体和纤维在一定的条件下可相互转化。本实验中M－缓冲液提供的离子条件可使纤维稳定。在Mg2+、高浓度K+、Na+诱导的条件下， F-actin趋于稳定，而在含ATP、Ca2+和低K+、Na+的条件下，F-actin趋于解聚。
为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。
去垢剂为一端亲水一端疏水的小分子，可将膜脂包围在内部，从而形成水溶性的分子，导致细胞膜系统的崩解，是分离与研究膜蛋白的常用试剂，可分为离子型去垢剂和非离子型去垢剂两类。
常用的离子型去垢剂有十二烷基磺酸钠SDS，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水键，使蛋白多肽链展开，SDS则以其烃链与蛋白分子侧链结合。SDS作用剧烈，能引起蛋白的变性。
TritonX-100又名聚乙二醇辛基苯醚，是一种非离子型去垢剂，作用温和，是研究细胞骨架蛋白的重要的工具药物。当用适当浓度的TritonX-100处理植物细胞后，可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质（能使95%以上的可溶性蛋白被抽提）和全部脂质被溶解抽提，而细胞骨架系统的蛋白质却保存完好，经考马斯亮蓝R-250染色，在光学显微镜下可观察到由微丝组成的微丝束为网状结构。 三、实验器材与试剂
1、材料：洋葱鳞茎。
2、器材：小烧杯、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、显微镜。 3、试剂： （1）、M缓冲液：
50mmol/L 咪唑 50mmol/LKCl 0.5mmol/LMgCl2 1mmol/L EGTA 0.1mmol/LEDTA 1mmol/L巯基乙醇
（2）、6mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）或6mmol/L PBS磷酸缓冲液 （pH 6.5）：
KH2PO4 : Na2HPO4·2H2O = 7:3
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（3）、1% TritonX-100，用M缓冲液配置。
（4）、0.2%考马斯亮蓝R-250： 46.5ml甲醇、 7 ml 冰醋酸 、46.5ml蒸馏水。
（5）、3%戊二醛 用6mmol/L磷酸盐缓冲液配置。（25% 戊二醛取12mL ，PBS 88mL ）
注：EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可使微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度 。
M－缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压。
四、实验步骤与方法：
（1）、取材：撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小）置于装有6mmol/L磷酸盐缓冲液的烧杯中，使其下沉。
（2）、抽提：吸去磷酸盐缓冲液，用1% TritonX-100处理20-30min.。 （3）、冲洗：吸去TritonX-100，用M缓冲液洗3次，每次10min。 （4）、固定：3%戊二醛固定30min。
（5）、冲洗：6mmol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。 （6）、染色：0.2%考马斯亮蓝R-250染色20min。
（7）、制片：用蒸馏水洗1-2次，将标本置于载玻片上，加盖片。 （8）、观察：光镜下可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在着染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，即为构成细胞骨架的微丝束
附：动物细胞骨架的显示与观察
（1）、涂片：用干净牙签刮取人口腔上皮细胞，置于1.5ml离心管中，加1ml生理盐水，混匀后3000转离心10分钟，剩0.5ml上清液，吹管吹打均匀、涂片、晾干。
（2）、漂洗：M缓冲液洗3次。
（3）、处理：1％Triton X－100 37℃处理30分钟，M缓冲液洗3次。 （4）、固定：3％戊二醛固定15分钟，磷酸缓冲液洗3次，滤纸吸干。 （5）、染色：0.2％考马斯亮蓝R250染色5分钟 （6）、封片：水洗制成临时片，镜检。 作 业：绘所观察到的细胞的骨架图
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思考题：
1、什么是细胞骨架？它有何主要功能？
2、、列举你所知道的动、植物细胞中由微丝组成的结构。
3、、显示细胞骨架的原理是什么？说明实验中使用的TritonX-100、戊二醛、考马斯亮蓝R-250的作用。
实验五：脂类细胞化学——苏丹Ⅲ染色法（一）
一、实验目的：
了解脂类染色原理、操作步骤及脂类标本制片原则。 二、实验原理：
脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等。脂类不溶于水，易溶于浓酒精、苯、乙醚等。故制作脂类标本，一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定剂。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法、特异染色法等。脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV（猩红）或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂类。 三、实验器材与试剂
1、材料：蟾蜍脂肪体压片或小肠系膜铺片或小鼠肠系膜铺片。 2、器材：解剖剪、眼科剪、眼科镊、载玻片、显微镜。
3、试剂：①苏丹红Ⅲ 1g溶入加温的70%乙醇溶液中过滤备用。②10%甲醛钙固定液：甲醛10ml，CaCl2 1g,加水至100ml。③甘油明胶：明胶12g，加入120ml蒸馏水中水浴加温使其完全溶解，再加入60ml甘油和1g苯酚，充分混匀后，４℃储存备用。④70%乙醇溶液 四、实验步骤与方法：
材料１：解剖蟾蜍，在卵巢或睾丸前方有分支花瓣状呈黄色或表面略带灰色的脂肪体，用眼科剪剪一小块（小米粒大小），放在载片中央，滴10%甲醛钙固定液固定２min,然后换滴苏丹Ⅲ饱和染色液一小滴，静置10min,加盖片，轻压盖片使组织稍分散，显微镜下观察。
材料２：取小鼠肠系膜平铺在载玻上，稍干后用10%甲醛钙固定液固定
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20min，蒸馏水洗后，70%乙醇溶液洗，然后用苏丹红Ⅲ饱和染色液染色30min，取出后在70%乙醇溶液中稍洗，甘油明胶封片。
结果观察：脂肪细胞呈圆球形，内充满橘红色脂类物质，细胞核呈指环状偏靠细胞膜边缘，细胞外也有散在的橘红色圆脂肪滴。 思考题：显示脂类时，制片及染色有何特殊之处？
实验五 DNA的原位显示—Fenulgen反应（二）
一、实验目的：
1、了解Fenulgen反应的原理；2、掌握有关的操作方法。 二、实验原理
Feulgen反应：DNA经弱酸（1mol/L HCl）水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff（无色品红亚硫酸溶液）试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基（醌基是一个具有颜色的发色团），所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。 三、实验器材与试剂
1、材料 ：洋葱根尖， 洋葱鳞茎表皮细胞
2、器材 ：光学显微镜，载玻片，盖玻片，剪刀，镊子，表面皿，小指管， 恒温水浴箱（2个），试管架，刀片
3、试剂：
1) 1mol/L HCl:取82.5 mL密度1.19g/ mL的浓盐酸加蒸馏水1000 mL。 2) Schiff 试剂：煮沸200mL 水，稍冷放入1g 碱性品红，充分搅拌有助溶解，50℃时过滤，置磨口棕色瓶内，向滤液中加1mol/L HCl 20mL ，待25℃时加偏重亚硫酸氢钠或亚硫酸钾 1g ，盖严放暗处，静止勿动，几天后，红色稍退，溶液呈无色或淡黄色，即可使用，如有红色，可加一勺活性炭，振荡过滤，黑布罩好。
3)亚硫酸水：取200 mL自来水，加10 mL10%（临用时配制） 4）5%三氯乙酸。
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