几种无机/有机纳米复合材料的电化学酶传感器研究
电极：GODred ? GODox + ne
与前两代酶生物传感器相比较，此类传感器既不需要氧，也不需要人工合成的媒介体作为电子传递体，甚至还不需要固定化载体，而是直接将酶分子吸附固定到电极表面，让酶的氧化还原活性中心与电极直接“亲密交流”，更快地传递电子，从而提高电化学酶生物传感器的响应速度和灵敏度，真正做到“无试剂分析”。由于酶的电活性中心深埋在酶分子的内部，且在电极表面固定后易发生变形，故在普通电极上很难实现酶与电极表面的直接电子转移。当前文献报道以过氧化物酶[35]、血红蛋白[36]、肌红蛋白[37]和细胞色素C[38]等为主。研究表明，在酶/电极界面进行修饰以形成某种仿生的微环境，有利于酶与电极表面的直接电子转移，同时保持酶的生物活性。纳米材料的引入，使酶与电极间的直接进行电子转移容易实现，例如，Hb、HRP和GOx在CNT/GC电极表面均能进行稳定而有效的直接电子转移[39]。因此，结合纳米修饰技术有望成为第三代酶生物传感器的研究方向和热点。 1.1.2.3 电化学酶生物传感器的应用
自1975年Yellow Spring公司研制出第一支用于全血中葡萄糖检测的葡萄糖分析仪并将其成功推向市场以来，电化学酶生物传感器的应用备受关注，越来越多的公司与科研单位致力于此类传感器的研究与开发，相应的论文与专利也急剧增加。近年来，电化学酶生物传感器在医疗诊断、食品安全、能源开发、环境监测以及军事等领域得到了较广泛的应用，集中体现在以下几个方面：
医疗诊断方面：葡萄糖传感器可以检测糖尿病患者血液中葡萄糖的含量。另外，生物传感器还可以对体液中的多种化学成分（如尿酸、乳尿素等）进行检测，从而为疾病的快速诊断提供可靠的依据[40]。
食品安全方面：目前，电化学酶生物传感器在食品安全分析中的应用很广泛，主要包括食品成分分析[41]、添加剂的分析[42]、有害毒物的分析[43]以及一些特殊指标（如食品鲜度）的测定[44]等方面。
能源领域方面：如Eugenii Kate[45]等运用电化学酶传感器技术研制了自供能源的微装置，以期用于人造心脏的自运行。
环境监测方面：对环境中污染物、农药残留量或废气进行监测。
军事应用方面：有机磷化合物为目前常用的生化武器，根据有机磷化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制机理，可构造电位型或电流型胆碱酯酶生物传感器来检测神经毒剂[46]。
1.2 纳米材料
纳米材料是20世纪80年代中期发展起来的一种具有全新结构的材料，由于其表面的晶体结构和电子结构发生了改变，因此具备许多与传统材料不同的特性。纳米科学技术是一门多学科交叉的新兴学科，与生物工程技术、计算机信息技术并称为21世纪的
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三大新兴技术[47]。纳米材料本身是纳米科学和技术发展的重要基石，是研究纳米科学和技术的理想平台。当前，人们在纳米材料的研究上已取得了卓越的进步，发展了制备纳米材料的多种方法。
1.2.1 纳米材料及其分类
1981年德国萨尔兰大学的学者Gleiter H.首次提出了纳米材料的概念。随后在美国召开的第一届国际纳米科技会议上，纳米材料科学被正式宣布为材料科学的一个新的分支。纳米材料是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度(1-100nm)内的材料以及由它们作为基本单元组装而成的结构材料，包括氧化物、金属、有机化合物和无机化合物等。纳米材料由于具有小尺寸以及特殊的表面状态，表现出许多诸如表面效应、体积效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应等优良性质。同时，纳米材料还具有独特的光学、热学、电学、磁学、力学和其它化学性质，从而在电子、化工、医学以及国防等领域展现出重要的应用价值，因此被美国材料科学学会赞誉为“21世纪最有前途的材料”。其中，由于具有比表面积大、吸附能力强、表面活性中心多、催化效率高以及表面活性高等特殊性质，纳米粒子的制备、应用及其理论研究方兴未艾。
纳米材料的分类方法很多，基本单元按照维数可分为四类：(1) 零维，指空间三维尺度均处于纳米尺度的材料，如原子团簇、纳米颗粒等；(2) 一维，指在空间有两维处于纳米尺度的材料，如纳米线、纳米棒、纳米管等；(3) 二维，指在空间有一维处于纳米尺度的材料，如超晶格、超薄膜、多层膜等；(4) 三维，指由零维、一维和二维材料为基本单元结合而成的块状材料，其空间尺寸均不在纳米尺度。
纳米材料按照形态不同一般也分为四类：(1) 纳米固体材料，指由尺寸小于15nm的超微颗粒在高压下压制成型，进而经过一定热处理工序加工所生成的致密型固体材料；(2) 颗粒膜材料，指将颗粒嵌入薄膜所生成的复合薄膜； (3) 纳米颗粒型材料，直接采用纳米颗粒作为应用形态； (4) 纳米磁性液体材料，指将包覆有一层有机表面活性剂的超细微粒高度弥散于某特定基液中，形成的稳定且具有磁性的液体。
1.2.2纳米材料结构体系
纳米材料结构体系是由纳米材料领域派生出来的一个重要的具有丰富科学内涵的分支学科，它以纳米尺度的物质单元为基础，遵循某种特定规律从而营造出一种新的体系，这些物质单元可以是纳米管、纳米颗粒、人造原子、稳定的团簇或者纳米尺寸的孔洞等。根据构筑纳米结构体系驱动力的不同，可归为两类：一是纳米结构人为组装体系；二是分子自组装体系和纳米结构自组装体系。纳米材料结构体系已成为纳米材料发展的一个重要方向。
本论文从组装有序纳米复合材料结构体系出发，依次采用原位自组装法、模板法、种子法构建了几种新颖的无机/有机电化学传感界面。以下为相关介绍。
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几种无机/有机纳米复合材料的电化学酶传感器研究
1.2.2.1 自组装法
自组装是指不借助外力作用，而通过弱的非共价键（如范德华力、氢键等）之间的协同作用使大分子或纳米粒子连接在一起，自发地在基底表面形成纳米结构薄膜，这种膜可以是单层膜也可以是多层膜。1995年，Bawendi等[48]首次发现了三辛基氧膦保护的CdS单分散纳米粒子能够自发组装在一起，形成排布有序的单层膜现象。研究一致认为，纳米粒子的这类自组装现象源于粒子间的范德华作用力。有这样一种简单的方法，取一滴单分散的胶体溶液滴在一个大小合适的基底表面，让溶剂缓缓蒸发，可以形成二维乃至三维有序的纳米结构。依此方法组装而成的有序膜最大能够达到几个微米尺度，同时组装条件非常严格，组装过程较难控制。二维纳米结构随着基底表面覆盖度的增加，也能够自发转变为三维纳米结构。Taleb等[49]将巯基保护的Ag纳米粒子分散在正己烷中，然后将喷碳过的铜网浸于上述溶液，3h后得到了有序、致密的结构。延长在溶液中浸入的时间，使之足够久以让溶剂完全蒸发，便可以得到组装有序的三维结构。Ast等[50]报道了将聚苯乙烯溶于甲苯溶液中，接着加入银纳米颗粒，超声分散，随后取部分溶液置于水面上，待甲苯蒸发，最后得到了有序的纳米结构薄膜。
层层自组装法是构筑有序纳米薄膜的常用方法[51]。借助于静电吸引作用，带有相反电荷的纳米粒子或物种能够交替吸附，一层一层的自组装起来。具有正负电荷对的聚电解质是组装过程中较为广泛使用的一类间隔层，由于其具有非常多的结合位点，因此能有效地提高纳米粒子组装膜的质量。层层自组装法通常采用的阴离子型聚电解质有：聚丙烯酸(PAA) 、聚乙烯磺酸盐(PVS) 以及聚苯乙烯磺酸盐(PSS) 等。常用的阳离子型聚电解质有：聚丙烯胺盐酸盐(PAH)、聚乙烯亚胺(PEI)以及聚二甲基二烯丙基氯化铵(PBDDA)等。这种交替组装形成层状纳米结构的过程可以通过电化学、紫外可见吸收(Uv－vis)光谱和石英晶体微天平(QCM)来检测跟踪。使用该方法能够制备均匀的大面积纳米结构薄膜，且在平整的基底表面甚至高度弯曲的界面上也很容易组装成膜。 1.2.2.2 模板法
模板法是指基于外加模板，通过纳米孔道的限制作用使纳米材料填充模板孔道进行制备的一类方法。将纳米结构单元组装到模板孔道中的方法有溶胶凝胶沉积、电化学沉积、化学聚合、化学气相沉积等。目前基于模板法制备Au、Ag、CdS纳米线[52-54]以及TiO2、碳纳米管、MoS2、PbTiO3[55-58] 已有相关报道。现常用的模板主要有高分子模板（聚碳酸酯、聚酯等）和氧化铝模板，多用于制备一维纳米材料。高分子模板的结构特点是孔洞呈圆柱形。而氧化铝模板的孔洞为六角柱形，孔的分布相比前者有序性稍好，垂直膜面呈有序平行排列。此外，多孔硅、介孔沸石、纳米孔洞玻璃也应用于模板法制备纳米材料。
将电沉积与模板法相结合来制备金属纳米线的方法称为电化学辅助模板法。该方法可以很好的控制孔的大小以及填充度、孔壁的厚度，常用来制备金属、合金、导电聚合物和半导体。由于技术灵活、工艺简单、沉积量容易控制，故容易实现工业化生产。最
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近，Laocharoensuk等[59]通过改变金、银电沉积混合液的比例，得到了纵向分段的纳米哑铃一维纳米结构和金银合金纳米锥。Ramanathan等[60]通过电沉积制备亲和素标记的功能化量子点聚吡咯纳米线，并应用于亲和DNA的传感设计。
模板法合成纳米结构阵列和纳米结构单元（包括零维、一维纳米结构），在纳米体系制备科学上占有非常重要的地位。根据需要设计、组装多种纳米结构体系，能以更多的自由度来控制体系的性质，能够得到常规体系所不具备的新特性，从而为设计性能卓越的纳米器件奠定了良好基础。模板法制备纳米结构体系具有以下几方面优点：(1)可以制备金属、合金、氧化物、导电高分子、半导体等纳米结构材料；(2)可以合成分散性良好的纳米管、纳米线以及它们的复合体系；(3)可以通过模板孔径的改变来调节纳米管或线的尺寸，甚至可以制备其它方法难以得到的尺寸极小的纳米管或纳米线；(4)可以制备具有纳米结构的阵列体系，显示出该方法的优越性。 1.2.2.3 种子生长法
近年来种子生长法引起了科学界的广泛关注，常用于合成液相中不同形貌和尺寸的纳米材料，其中金属纳米材料的合成就是一个典型的例子。种子法本身具有不少优点，能制备单分散、形貌一致且产率大的纳米材料，通过控制某种特定的制备条件可以实现对纳米材料形貌和尺寸的控制。具体来说，在还原剂和一定目标离子（前体）的存在条件下，采用化学还原法以小尺寸种子为晶核生长出形貌可控的纳米材料。值得注意的是，表面活性剂对晶核附近的化学还原起着非常重要的作用。化学还原法是最常用的晶核生长方式，此外也有使用辐射法、醇热法等相关报道。
Niu等[61]用22 nm的钯种子合成了37~109 nm的立方体单分散纳米钯，并考察了种子大小、种子数量以及表面活性剂类型对制备纳米颗粒的影响，同时做了相关生长机理的推断。Yang等[62]运用种子生长法，用2.5 nm的金种、硝酸根离子辅助合成了纵横比大于20的金纳米棒。Liu和Jiang [63]将银种子修饰到硅纳米颗粒表面，然后以银种为成核位点，还原生长银纳米颗粒，进而合成了覆盖均匀的硅核银壳纳米材料。Zhang等[64]运用种子生长法在树枝状纳米铜外延上生长氧化铜纳米线阵列。Mallik等[65]以纳米金做种子，紫外光辐射制备金核银壳纳米颗粒，探究了辐射时间和金种的量对核壳纳米颗粒生长的影响，并对纳米颗粒的形成机制进行了阐述。
Oyama研究小组[66-68]报道了运用种子法在ITO玻璃表面生长金属纳米颗粒的一系列工作，通过将ITO玻璃依次浸入种子液和生长液中，金属纳米颗粒能牢固地生长在小尺寸种子周围。这种方案是在液相种子法的基础上发展出的液固相种子生长法。基于此，随后的Oyama和Umar [69]在ITO基底上制备出了分布垂直的单晶氧化铜纳米线。有理由相信，运用种子生长法在固相基底上修饰有序纳米结构材料将具有广阔的应用前景。
1.2.3纳米材料在电化学生物传感器中的应用
纳米材料所拥有的众多优越特性，使其在航天、机械、电子、化工、医药、生物工
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程、陶瓷等多个方面具有广阔的应用前景。同时，纳米材料的介入为传感器的发展注入了新鲜的血液。具有纳米结构的材料可以广泛地应用于信号的检测、放大以及敏感分子的固定。与传统的传感器相比，基于纳米材料的新型传感器灵敏度高、选择性好、响应迅速，可以实现高通量的实时分析检测。
纳米材料具有良好的电催化活性。固定到电极表面的金纳米颗粒能用于催化电化学反应以及增大响应的灵敏度[70,71]。金属铂纳米颗粒修饰的电极对过氧化氢有较强的催化性能，固定上酶能构建生物传感器，同时铂纳米颗粒及其纳米线能对甲醇进行催化氧化，是一类非常有效且不易替代的催化剂[72-74]。Hrapovic等[75]将铂纳米颗粒同碳纳米管相结合用于制备葡萄糖传感器。利用电荷间的相互作用，将单壁碳纳米管分散在带负电的聚合物膜Nafion中，铂纳米颗粒能很容易地沉积到碳纳米管上。同只有碳纳米管或只有铂纳米颗粒的电极相比，两者的结合显著降低了检测下限，极大提高了灵敏度。
纳米材料大的比表面积能提高酶的负载量，同时良好的生物相容性有利于提供酶稳定的微环境。如金纳米颗粒被大量用于吸附蛋白质从而实现蛋白质的固定[76,77]。同修饰了纳米颗粒的传感器相比，一维纳米材料（纳米管、纳米线等）的应用进一步提高了传感器的性能[78, 79]。Rishpon等[80] 用自组装方法将制备的缩氨酸纳米管修饰到金电级表面，在0.4 V下研究了电极对NADH和过氧化氢的直接电化学行为。然后在缩氨酸上固定上葡萄糖氧化酶，所构建的葡萄糖生物传感器具有良好的性能，同时，电极对NADH的电催化活性使其对乙醇的检测获得很高的灵敏度。Zhou等[81]提出了将钛酸盐纳米管用于固定肌红蛋白研究直接电子转移的方案。研究表明，与二氧化钛纳米颗粒相比，肌红蛋白在钛酸盐纳米管上能保持更高的电子转移效率和生物活性，同时电极对过氧化氢的检测得到了较低的检测下限。
这里，我们通过对纳米材料性质研究以及对比上述不同结构纳米材料在生物传感器中的应用，推测出纳米材料增强传感器性能的可能机制为：
(1) 纳米材料的比表面积大，表面自由能高，纳米颗粒表面对生物活性物质的吸附量增加，并能强有力地固定，因而能有效防止生物活性物质的流失，提高了电极电流响应的稳定性和灵敏度。
(2) 纳米材料的表面效应导致其表面存在众多悬空键，使得化学活性较高，同时纳米固体材料具有较强的表面亲水性，这些特性都增强了材料的生物相容性。
(3) 纳米材料具有宏观量子隧道效应，纳米粒子能促进酶的活性（氧化还原）中心与电极之间的电子传递。
由此可见，当今生物传感器发展的重点和热点之一就是发展新型纳米材料，充分发掘其优越的纳米性能，从而实现酶的稳定和高活性固定。
1.3 本研究论文的构想
采用纳米材料构建生物传感器是目前的研究热点。在广泛查阅文献并结合本实验室
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