硕士学位论文
原有工作基础上，本文采用原位自组装法、模板法、种子法等在传感界面制备纳米复合材料，用于构建性能优良的新型电化学酶生物传感器。围绕这一思路，开展了以下三个方面的工作。
(1) 提出了一种在电极表面直接制备金属微粒的方法。即在电极表面电沉积聚丙烯酸膜，利用其羧基键合金属离子特性,在其表面原位自组装了基于双金属纳米微粒的化学修饰电极，对过氧化氢表现出了良好的电催化性能。
(2) 采用模板法电化学沉积，制备了比表面积大，具有空间取向和大量吸附位点、生物相容性好的羟基磷灰石纳米阵列，并将其用于氰化物传感器的构建。分布密集的羟基磷灰石纳米线阵列不仅可以使底物与酶生物分子充分接触，还使固定的酶保持了良好的生物活性，是一类优异的电化学生物传感界面。
(3) 运用种子生长法一步合成制备铁氰化钴纳米复合材料。所制备的纳米复合材料在碳纳米管的协同作用下，展现出了良好的电化学催化性能。
- 9 -
几种无机/有机纳米复合材料的电化学酶传感器研究
第2章 基于聚丙烯酸网状物原位组装双金属纳米粒子构
建过氧化氢传感器
2.1 前言
众所周知，由于大的比表面积赋予其优越的电催化性能，金属纳米粒子在传感领域中的应用日益广泛。铂族贵金属纳米材料作为一类理想的高效催化剂[82-85] ，在催化领域引起了科学界浓厚的研究兴趣。如钯在低电位下对双氧水良好的催化性能[86,87]。同时，关于聚合物稳定的两种或以上金属元素组成均相多金属催化剂的研究方兴未艾。双金属催化剂具有一些比单金属催化剂优异的性能，例如，提高反应速率、选择性以及新的反应类型[88,89] 。
通常为了防止纳米颗粒的团聚，研究中微粒一般分散于有机或聚合物基体中，然后再直接滴涂到电极表面。如在溶液中用带羧基、氨基、磺酸基、亚氨基等具有金属配位能力的聚合物作反应器自组装金属纳米/微米粒子的方法已有不少报道[90-93]。电极的性能很大程度上依赖于金属微粒在复合膜中的尺寸和密度，但所提及这些方法中的金属微粒都是用溶液法预先合成的，待修饰到电极表面后其尺寸和密度较难再调控。另一方面，将聚合物反应器构筑于电极表面直接合成金属微粒用于电化学传感器的相关报道却不多见[94,95]。
近期，Willner 和他的课题组[96-98]发展了一种在电极表面直接电沉积聚丙烯酸(PAA)以合成金属纳米簇，充当电子传导媒介的方法。借鉴其发挥PAA的优势，并结合双金属催化剂可有效提高催化活性这一特性，本文发展了一种直接在电极表面制备双金属微粒的方法来构建H2O2检测传感器。具体说来，即先在电极表面修饰PAA，然后利用聚丙烯酸的羧基（带负电）自组装吸附金属离子（带正电），最后化学还原金属离子成微粒。相比于预先制备金属微粒再用于组装，该方法操作简单，聚丙烯酸的网状结构可使原位生成的金属微粒分散均匀，同时通过控制PAA膜上金属离子的数量和“收缩-溶胀”循环次数还能实现对金属微粒尺寸和密度的控制。这里，PAA被用作金属纳米/微米粒子的反应器，基于双金属（一定比例）的修饰电极对双氧水表现出了良好的电催化活性。另外，PAA上的自由羧基还可共价键合抗体、带氨基的酶等一系列物质。因此，通过改变金属离子的种类以及固定不同种类生物分子，该方法有望构建许多新型的化学生物传感器。
- 10 -
硕士学位论文
2.2 实验部分
2.2.1试剂与仪器
N, N’-亚甲基丙烯酰胺购于Sigama–Aldrich公司。丙烯酸(分析纯, 使用前减压蒸馏)。磷酸盐缓冲液（1/15M，PBS，pH6.98）作为电化学测定的支持电解质。所有其他试剂均为分析纯，所有试剂均用二次蒸馏水配制，所有电化学测试均在室温下进行。
扫描电镜(SEM)采用JSM-5600LV显微镜（日本JEOL公司）。循环伏安、计时电流和阻抗分析采用上海辰华仪器公司CHI 760B电化学工作站。实验所用的三电极体系(10 mL)中，修饰了的金电极(Au)为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极。所有实验均在室温条件下进行。
2.2.2 金电极表面的处理
将金电极分别用0.3 μm和0.05 μm 铝粉打磨后，分别置于水、无水乙醇和水中超声清洗5min，再用piranha 溶液（浓H2SO4∶30% H2O2＝7∶3）浸泡20 min，用水冲洗后，在0.1 M H2SO4中循环伏安扫描（-0.3到1.55 V, 0.1 V s?1）直至出现理想的金氧化还原特征峰。
2.2.3 聚丙烯酸/双金属纳米颗粒传感界面的制备
根据文献[96-98] 在金电极表面修饰聚丙烯酸(PAA)。在含2 M 丙烯酸、0.04 M N, N’-亚甲基丙烯酰胺和0.2 M ZnCl2（调pH 6-7）的水溶液中进行循环伏安电聚合（扫描速率50 mVs?1，电压范围-1.5 到+0.1 V，扫描圈数5圈）。电聚合完毕后，电极用0.1 M HCl浸泡5 min以溶解表面的金属锌，然后用蒸馏水和无水乙醇清洗表面残余的Zn2+和未反应（过量）的丙烯酸单体。
修饰电极进一步结合双金属纳米颗粒的方法拟参考文献[99]报道的结合单金属微粒的方法，稍作改动如下： 把PAA修饰的金电极(PAA/Au)在丙酮中浸泡5 min以收缩PAA薄膜；然后将其在一定比例贵金属溶液（10 mM[Pt(NH3)4](NO3)2和Pd(OAc)2）中浸泡5 min，聚合膜发生溶胀并吸附混合金属离子，从而使金属离子组装在PAA膜上。金属离子的吸附量可通过“收缩-溶胀”的循环次数来控制。通过在丙酮、贵金属混合液中反复的“收缩-溶胀”过程，更多的金属离子能进一步渗进PAA聚合膜中；最后将电极在蒸馏水中搅拌清洗20 min以除去未被键合的离子。
纳米金属颗粒的原位还原：在结合金属离子的PAA /Au电极表面，滴加20 ?L水合肼(2.4 mM)室温下还原30 min，以将金属离子还原成金属微粒。
- 11 -
几种无机/有机纳米复合材料的电化学酶传感器研究
2.2.4 H2O2的响应检测
(a) 循环伏安法
在不同浓度的H2O2中，于-0.8V到+0.2V下做循环伏安图。 (b) 计时电流法
在一定电位下，分别对每个电极做4个阶梯计时电流图。
2.3 结果与讨论
2.3.1实验条件优化 2.3.1.1循环次数的优化
我们考察了循环次数对电极响应效果的影响。双金属混合液为比例1:1的0.01M Pd(OAc)2和0.01M的[Pt(NH3)4](NO3)2溶液。吸附时，在丙酮中浸泡5分钟，再在双金属离子溶液中浸泡5分钟。
取4根电极依次“收缩-溶胀”1、2、4、6次，其它步骤相同。对4根电极依次在电位-0.1V下的磷酸盐缓冲液(PBS)中滴加1mM H2O2，检测其计时电流响应大小，得到如下图2.1。可以观察到，当循环次数为4次时，达到最大电流响应值。而在此增加循环次
1.41.21.0I/uA.8.6.4.201234567循 环 次 数 图 2.1 “收缩-溶胀”循环次数优化图
数（6次）时，响应反而下降。循环次数为2次时，电流响应值也已接近4次。综合考虑电流响应和循环步骤，实验采用“收缩-溶胀”循环次数2次为最佳。
2.3.1.2 双金属比例的优化
取5根电极（标号）分别在0.001M 的Pd(OAc)2和0.001M的[Pt(NH3)4](NO3)2溶液。按如下比例吸附金属离子：
1号： Pd : Pt = 1 : 0
- 12 -
硕士学位论文
2号： Pd : Pt = 4 : 1 3号： Pd : Pt = 1 : 1 4号： Pd : Pt = 1 : 4 5号： Pd : Pt = 0 : 1
吸附时, 同样在丙酮中浸泡5分钟, 再在金属离子混合溶液中浸泡5分钟。“收缩-溶胀” 循环2次，清洗后水合肼还原。对5根电极依次在电位-0.1V下的磷酸盐缓冲液(PBS)中滴加1mM H2O2，检测其计时电流响应大小，结果如图2.2所示。
543I/uA21012345电极编号 图2.2 双金属吸附比例优化图
可以明显看出，Pd:Pt = 1:4的4号电极有着最大的电流响应。因此本实验采取Pd:Pt = 1:4作为双金属混合液的比例。
2.3.1.3 电位的优化
我们考察了电位对所修饰电极电化学响应的影响。当电位小于-0.1V时，电极对H2O2表现出较大的响应。同时，电位越负响应电流越大。本文中选取-0.1V作为检测电位。在如此低的电位下，背景电流得到了降低，测定中常见干扰物质的影响也被降到最低。
2.3.2 SEM表征
采用扫描电镜对优化条件下修饰的的金电极进行了形貌表征。下图即为聚丙烯酸/双金属纳米颗粒修饰的金电极界面。从图中可以观察到，亮白色的金属纳米颗粒均匀而较密集地分散在PAA 网状结构中，平均粒径为250nm。
- 13 -