几种无机/有机纳米复合材料的电化学酶传感器研究
12108642070AInhibition/`aB50I/?A4030b2010-.3-.2-.10.0.1.2-.20-.15-.10-.050.00.05.10.15.20E/V vs SCECol 1 vs Col 2 Col 1 vs Col 3 E/V vs SCE 图3.5（A）电位对2 mM H2O2还原信号的影响（B）电位对两个浓度水平的氰化物抑制率的影响 a) 40 ng mL-1 b) 16 ng mL-1（H2O2浓度为0.6 mM）
3.3.4.2 pH值的优化
pH值与界面稳定性、酶的活性以及氰化物离子的存在形式息息相关，这都将直接影响生物传感器的抑制性能。图3.6显示了16 ng mL-1氰化物在pH 4.9-9.2范围内的抑制效果。如图所示，当pH为7.65时的抑制效果最好。分析如下：在该pH值下，HRP酶的活性保持良好；弱碱性环境中CHIT和HANWA能保持稳定；氰化物能保持阴离子形式；pH7.65介于HA的等电点(7.3)和HRP的等电点(8.3)之间，可通过静电作用促进HANWA对HRP的吸附。故本实验采用7.65为理想pH值。
3025Ihibition/ 1556789pH 图3.6 pH值对氰化物抑制率的影响（电位-0.1 V, 氰化物浓度为16 ng mL-1）
3.3.4.3 H2O2用量的优化
H2O2用量会对抑制效果产生巨大影响。一般来说，要兼顾高的灵敏度和宽的线性范围。降低H2O2用量会使得催化电流信号减小，这会限制氰化物检测的线性范围；增加H2O2用量虽会得到更宽的线性范围，但灵敏度随之降低。过量的H2O2则可能会占据大量酶催化活性中心，使之对抑制剂不敏感，从而降低氰化物检测的灵敏度。图3.7显示
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了H2O2用量对氰化物(8 ng mL-1)抑制率的影响。综合考虑灵敏度和检测线性，我们选用H2O2用量为0.6 mM。
454035Inhibition/025201510.2.4.6.81.01.21.41.61.82.02.2H2O2/mM 图3.7 H2O2用量对氰化物抑制率的影响（电位-0.1 V 氰化物浓度为8 ng mL-1）
3.3.5 氰化物传感器的性能分析
常用计时电流法来测定酶活性和酶抑制。通过计算H2O2还原电流的降低实现样品中氰化物浓度的测定，记录加样后的准稳态电流值（10 min内）来绘制标准抑制曲线。抑制率由方程I (%) = [(I0-I1)/I0]?100 获得，其中，I1和I0分别是0.6 mM H2O2在添加氰化物前后的准稳态电流值（在pH 7.65的10 mM PBS中进行）。图3.8显示了在优化实验条件下，所得到的传感器抑制率对氰化物浓度的标准曲线。氰化物的线性范围是2 ng mL-1 到80 ng mL-1；检测下限为0.6 ng mL-1（抑制率为10％）。
抑制反应完成后，用超纯水洗涤传感器60 s，HRP-CHIT/HANWA/GC传感器即可获得有效再生，且再生快速，优于相关文献报道的电极冲洗过夜[118]。再生30次，该传感器仍能基本保持初始的抑制能力。考察该传感器的重现性，对20 ng mL-1氰化物进行检测，分别用6支电极和同1支电极测6次，得到的相对标准偏差分别为4.23%和1.62%。
12010080Ihibition/`40200020406080100CN concentration/ng mL-1 图3.8 在优化条件下抑制率对氰化物浓度的标准曲线
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选择性是衡量抑制型酶传感器性能的重要指标之一，实验考察了多种阴离子和阳离子对10 ng mL-1氰化物测定的干扰情况，测定影响见表3.1。由表可以看出，硫化物和镉对实验测定的干扰较大。
表3.1 传感器的干扰实验数据（氰化物浓度为10 ng mL-1）
Test substance Cl- CO32- PO43- SO42- S2- Na+ K+ Hg2+ Pb2+
Contenta 100 100 100 50 5 100 100 10 10
Current ratiob 0.99 0.99 0.99 0.98 0.65 0.99 0.99 0.97 0.98 0.82
Cd2+ 10 a干扰物与氰化物的浓度比 b
干扰物和氰化物共存时与氰化物单独测定时的电流比
我们通过测试加标样品回收实验进行本方案的准确性验证（添加不同浓度的已知含量的氰化物到自来水样中），结果见表3.2，得到满意的回收率。为进一步考察本抑制型传感的适用性，将其用于检测湘江水中的氰化物含量，并与比色方法的结果相比较。结果见表3.3，两种方法的检测结果较一致。
Added (ng mL)
4.00 10.0 60.0
-1表3.2 自来水加标回收实验 (n=3)
Found (ng mL-1) Recovery (%)
3.94 10.2 60.2
98.5 102.0 100.3
RSD (%) 4.59 1.80 2.94
表3.3 传感器与比色法测定实际样品河水中的氰化物含量 (mean ± SD, n=3)
Content by the proposed biosensor Content by the calorimetric method (mg
Sample
(mg L-1 or mg kg-1) L-1 or mg kg-1) River water
0.004 ± 0.001
0.005 ± 0.001
与已报道的氰化物传感器相比，本传感器的检测下限比其中多数氰化物传感器要来的低，例如，基于卟啉/肌红蛋白[119]的光学传感器，压电石英晶体微天平传感器[120]，基于多酚氧化酶/粘土[121]和氰化物酶[122]的电化学传感器。本方案制备的
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HRP-CHIT/HANWA氰化物生物传感器成本小、分析时间短、检测下限低、再生性好、线性范围适合，且无需额外的电子媒介和其它种类的酶。
3.4 小结
由于HANWA具有表面积大、空间有序、多孔性等特点，基于CHIT/HANWA的生物传感器一方面可使固定的酶分子保持天然的构型和良好的生物活性，另一方面能实现快速的电子传递。HRP的固定是一种杂化方式，它包埋于生物材料CHIT中，从而使HANWA对CHIT/HRP具有很强的吸附作用。HRP-CHIT/HANWA氰化物生物传感器具有样品用量少、响应迅速、检测灵敏、再生快等优点，对食品与环境污染物测定提出新颖方法，拓宽了化学生物传感器的应用领域。
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第4章 基于铁氰化钴纳米颗粒/碳纳米管的葡萄糖电化
学生物传感器
4.1 前言
单组分纳米材料，如金属、金属氧化物、硫化物、多晶过渡金属氰化物、二氧化硅等在过去的几十年发展中得到了广泛的关注。纳米复合材料，为含有纳米尺寸材料的复合体系，由于具有协同效应和整合单组分纳米材料优势的特性，能极大地改善传感器的性能[123-126]，因而具有更广阔的应用前景。
碳纳米管(CNT)由卷曲成圆筒形状的石墨烯片组成，按照石墨烯片的层数分类可分为：单壁碳纳米(SWCNT) 和多壁碳纳米管(MWCNT)。CNT的长度从μm到cm不等，具有很高的纵横比，可以作为复合纳米材料的良好支架[127]。由于电学性能独特、化学稳定性好和比表面积大，CNT已被广泛地应用于电催化和传感技术的研究[128]。近来，结合CNT与其他材料，如导电聚合膜、氧化还原分子介体以及金属纳米颗粒等组成的复合纳米材料，引起了人们浓厚的兴趣。
金属铁氰化物(MHCFs) 作为一种优良的电子媒介物，具有良好的电催化、离子交换、离子感应、电致变色和光磁属性，其无机聚合物已被广泛应用于电化学催化鸟嘌呤、多巴胺、半胱氨酸等的氧化，以及CO2和水合肼等的还原。一般来说，合成金属铁氰化物的经验方法包括化学沉积[129]，电化学沉积[130] 和LB膜技术[131]。将铁氰化物修饰在基底上的方法则有机械摩擦、自组装、电沉积和包裹法[129,130,132]。需要注意到，铁氰化物纳米材料的制备及其于基底上的修饰是分步骤进行的。在金属铁氰化物中，铁氰化钴(CoHCF)，由于其具有独特的化学及电化学特性，尤其引人注目[133-136]。
种子生长法常用于溶液中纳米材料的制备，尤其是金属纳米材料。如Yang等[62]利用种子媒介生长法，用2.5 nm金种、硝酸根离子辅助合成了纵横比大于20的金纳米棒。然而，将种子生长法用于构建生物传感器的报道还鲜见。本章旨在运用种子生长法在修饰有CNT的玻碳电极(GC)上组装铁氰化钴纳米颗粒。此方法简单易行，只需浸入生长溶液中即可一步完成铁氰化钴纳米颗粒的修饰，不需任何特殊的交联试剂，展现出极佳的电子传递能力和电催化性能。固定上葡萄糖氧化酶，该传感界面即可用于葡萄糖的检测。
4.2 实验部分
4.2.1 试剂与仪器
约为95%纯度的多壁碳纳米管购于深圳纳米科技有限公司。氯金酸(HAuCl4·3H2O)
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