硕士学位论文
从而酶与相应底物的电化学响应随之降低，我们通过检测相应底物的电化学信号降低量，就能对酶抑制剂实现定量分析。
本章报道了一种基于羟基磷灰石纳米线阵列和辣根过氧化物酶(HRP)的抑制型氰化物生物传感器。羟基磷灰石纳米线阵列和壳聚糖相结合，可实现大量生物分子的有序化固定，为电化学信号转换提供了优良的传感界面，同时生物活性保持良好，有利于氰化物的灵敏检测。
3.2 实验部分 3.2.1 试剂与仪器
刻蚀多孔聚碳酸酯膜（PC膜, 孔径0.2μm） 购于 Whatman 公司，使用前在膜的一面先喷溅一层金薄层。辣根过氧化物酶（HRP, 250 U mg-1）购于上海凯洋生物技术有限公司。Ca(NO3)2、NH4H2PO4 以及其他化学试剂均为分析纯，购于上海国药化学试剂有限公司。KCN (100 mg L-1) 标准储备液来自湖南省疾病预防控制中心。除另有说明，使用的支持电解质是含0.1 M KCl的10 mM PBS (pH 7.0)。实验中所用超纯水的电阻值为18.2 MΩ cm。
扫描电子显微镜(SEM)采用JSM-5600LV 显微镜(日本JEOL公司)。循环伏安和计时电流测量采用上海辰华仪器公司CHI 760B 电化学工作站。电化学分析采用传统三电极系统，修饰Au电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极。所有实验均在室温下进行。
3.2.2 羟基磷灰石纳米阵列的制备
玻碳电极（GC，直径4 mm）先后用砂纸、铝粉依次抛光，在水、乙醇中超声清洗。 将PC膜用银胶固定到清洗后的GC表面，采用阴极恒电流沉积法直接在GC表面合成羟基磷灰石纳米阵列(HANWA)，电沉积条件依照相关文献做了轻微改动[114]。本实验采用的制备方法如下：首先在含25 mM NH4H2PO4 和42 mM Ca(NO3)2的溶液中，以电流密度 0.005 mA mm-2电沉积5 min，然后在氯仿中溶掉PC模板。
3.2.3 酶传感界面的制备
壳聚糖溶液（CHIT，0.5 wt. %）的制备如下：常温下，取0.025 g CHIT薄片置于5 mL 1.0% 的醋酸溶液中，搅拌直至完全溶解。将0.5 wt. % CHIT 和10 mg mL-1 HRP溶液等体积混合，滴加8 μL混合液于HANWA修饰的GC表面，室温干燥。制备好的酶传感电极不用时置于4℃下保存。该酶传感电极表示为CHIT-HRP/HANWA/GC，其他简称同理表示。
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几种无机/有机纳米复合材料的电化学酶传感器研究
3.2.4 电化学检测
循环伏安量测所用电解质溶液是含0.1 M KCl的10 mM PBS。交流阻抗量测在含0.1 M KCl 和 5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的10 mM PBS (pH 7.4)中进行，频率范围为 1-100 000 Hz。计时电流测量在含0.1 M KCl的10 mM PBS中搅拌条件下进行，工作电位为?0.1 V。
3.2.5 氰化物的抑制率方程
静止条件下，在加入H2O2（或氰化物）前、后的PBS溶液中进行循环伏安测量，取扫描电位范围为?0.4到0.6 V，扫描速率100 mV s-1。于5 mL PBS 溶液中进行计时电流测量，先加入一定浓度H2O2，当响应电流达到稳态时，迅速加入5 μL一定浓度的氰化物样品溶液。稳态响应电流值记为I0；当加入氰化物溶液后，其对酶生物活性产生抑制，此时的响应电流记为I1。抑制信号与氰化物浓度密切相关，以抑制率(I, %)对氰化物浓度作校正曲线图。抑制率方程[112]为: I (%) = [(I0? I1)/I0]?100，其中I0和I1分别是酶底物(H2O2)存在下，加入氰化物前、后的电流响应值，因氰化物抑制了酶的活性，故I0大于I1。
3.2.6 氰化物的实际测定
自来水样品无需前处理，直接用于回收率实验。取实际样品（湘江水），用本传感器和经典比色法对其进行氰化物含量的测定。比色法的原理是氯胺-T氧化HCN为CNCl，该化合物能与吡啶-巴比妥或异烟酸-吡唑啉酮反应生成蓝色物质，于638 nm处定量。
3.3 结果与讨论
3.3.1 羟基磷灰石纳米阵列的SEM表征
采用扫描电镜对修饰了HA纳米阵列的GC表面进行形貌表征。图3.1为高密集、有序排列的HA纳米线阵列扫描电镜图。图中HA纳米阵列由平均直径为200 nm，长度为1 μm的呈垂直分布的HA纳米线组成，纳米线的平均直径与PC模板的孔径吻合一致。由图可知，相邻纳米线的间距远大于其自身的直径，因此，这些纳米线在修饰上酶生物分子后可看作单个的纳米电极[115]。根据扫描电镜图我们计算出，纳米阵列中纳米线的分布密度约为5×108 cm?2。得到的HA 纳米阵列具有优良的生物相容性、大的表面积以及众多的吸附位点，可用来构建生物传感器。
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图3.1 恒电流0.005 mA mm-2沉积5 min得到的羟基磷灰石HA纳米线阵列的扫描电镜图（A）低倍数放大（B）高倍数放大
3.3.2 传感界面的电化学表征
电化学阻抗谱图是一种高灵敏度的检验修饰电极界面性质的有效方法。半圆的直径，也就是电子转移阻抗Ret，可用来描述电极的界面性质。图3.2为表征电极表面逐步修饰的电化学阻抗图谱。由图可知，裸GC的阻抗图几乎为一条直线，Ret约30 Ω（曲线a）。曲线b的Ret约为527 Ω，比前者有所增加，表明HA纳米阵列修饰电极基本上不影响界面电子的转移特性，这归功于HANWA固有的多吸附位点和疏松构造。即高密度HANWA具有大的表面积和丰富的吸附位点，能提供优良的电化学界面，有助于电化学生物传感器的构建。当HANWA/GC表面修饰HRP-CHIT后，Ret急剧增加到2422 Ω（曲线c），表明HANWA大的表面积和丰富的吸附位点有利于HRP-CHIT的固定组装。
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180016001400-Im(Z)/Ohm cm212001000c8006004002000ab05001000150020002250030003500Re(z)/Ohm cm 图3.2 逐步修饰电极的阻抗图（a）裸玻碳电极（b）a修饰HANWA（c）b固定chitosan-HRP
实验通过对HRP-CHIT/HANWA/GC连续扫描CV（电压范围-0.4到0.6V，扫描速度50 mV s-1），探讨该电化学界面的稳定性。连续扫描10圈，电流信号无明显改变，表明HRP-CHIT/HANWA/GC电化学界面稳定。
HANWA表面充满正负电荷以及丰富的吸附位点，促进了空间有序吸附和成膜过程，这种生物友好的环境实现了包埋于CHIT中的酶生物分子在HANWA表面的大量固定和良好的空间取向。而CHIT优良的生物相容性、成膜能力、渗透性和机械强度有利于提高生物传感器的性能。所制备的有机/无机复合膜很好地保持了固定酶的活性，为酶与底物的充分接触提供了良好界面。
3.3.3 氰化物的抑制响应
为研究氰化物对固定HRP的抑制效应，实验考察了HRP-CHIT/HANWA/GC在特定溶液中的循环伏安曲线，结果如图3.3所示。当加入过氧化氢后，由于HRP的特异性催化使得阴极、阳极电流均有大幅度增加（曲线b）；当加入氰化物后，阴极还原电流明显降低，表明氰化物可显著抑制HRP的催化活性。
图2.3 CHIT-HRP/HANWA生物传感器抑制性能循环伏安图（a）10 mM PBS （b）a加2 mM H2O2（c）b加20 ng mL-1氰化物（扫速100 mVs-1）
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图3.4显示的是HRP-CHIT/HANWA/GC界面在?0.1V电位下于10 mM PBS中对0.6 mM H2O2以及连续加入不同浓度的氰化物的实时响应图。检测液中加入H2O2后出现了一个明显的催化还原电流，且在短时间内达到稳态。随后加入一定浓度的氰化物，还原电流逐步减低。当加入1 ng mL-1氰化物时，仍可观察到较小的电流改变。由图3.4可以清晰看出，抑制信号随着氰化物浓度的增加而增加。当H2O2浓度一定时，催化电流只与酶的活性有关，从而根据氰化物对HRP的抑制程度便可实现对氰化物的定量检测。
图3.4 CHIT-HRP/HANWA生物传感器对0.6 mM H2O2及连续加入的不同浓度氰化物的计时电流响应（电位-0.1 V）
HRP有一个亚铁血红素半族，其作为活性中心与组氨酸残基的咪唑环配合（第五个配合位点），第六个配合位点亚铁红素铁(III)是与H2O2的反应位点。氰基的强配合作用阻止H2O2与亚铁血红素活性位点的接触，故H2O2 的还原信号被抑制[116]。实验发现，氰化物对HRP的抑制可在发生抑制反应后通过迅速使用超纯水清洗电极而获得恢复，表明该氰化物抑制传感器可反复使用，同时也证明氰化物对HRP的抑制为可逆抑制，这与相关文献的报道一致[117]。本方案采用了具有空间导向性、生物相容性好的HANWA来固定酶，有效参与反应的酶分子数量在一定程度上影响着抑制效果。包埋HRP的壳聚糖功能膜允许小分子渗透，实现了溶液中或界面上的电化学检测。
3.3.4 实验条件优化
3.3.4.1 工作电位的优化
图3.5A所示为传感器在不同工作电位下对2 mM H2O2催化电流的影响。如图可知，在?0.2至0.15V范围内，催化电流随着电位的增加而降低。电位对抑制效应的影响并非如此简单，酶的抑制程度是一个动力学的过程。图 3.5B为电位对抑制率的影响（考察氰化物在两个浓度水平下的的抑制率）。可以看出，电位越正抑制率越小，当电位为?0.1 V时，最大抑制值出现，因此本实验选用?0.1 V作为工作电位。
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