目 录
摘要 ........................................................... 1 1引言 ...................................................... 3 2实验部分 .................................................. 6 2.1 试剂与仪器 ........................................... 6 2.2 纳米金的制备 ......................................... 6 2.3 实验方法 ............................................. 6 3 结果与讨论 ................................................ 7 3.1 基本原理 ............................................. 7 3.2 比色检测 ............................................. 8 3.3 紫外可见吸收光谱 ..................................... 9 3.4 实验条件的优化 ...................................... 10 3.4.1 邻苯二胺浓度的影响 ................................ 10 3.4.2 HRP酶浓度的影响 .................................. 10 3.4.3 吸附时间的影响 .................................... 11 3.4.4 反映温度的影响 .................................... 11 3.5 传感器的响应性能 .................................... 12 3.6 回收率 .............................................. 14 4 结论 ..................................................... 14 参考文献 ................................................... 15 致谢 ....................................................... 17
基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
赵敏
化学化工学院 应用化学 08102班
摘要 本文发展了一种基于未修饰的金纳米粒子的均相比色法用于过氧化氢（双氧水）的检测。在邻苯二胺/过氧化物酶的溶液中加入过氧化氢，反应10分钟后，未修饰的金纳米粒子作为“反应指示剂”加入到反应溶液中。所得混合溶液的颜色很快从红色变到蓝色。可能是辣根过氧化物酶催化邻苯二胺生成偶氮苯从而导致金纳米颗粒的团聚。使用此方法，过氧化氢可以在约4个数量级的浓度范围内进行半定量分析。如果以420 nm处吸收峰强度对浓度做标准曲线，可以准确测定低至1.3×10-6 M的过氧化氢。与传统的电化学方法相比，这种传感策略具有几个重要的优点：（1）能够用肉眼直接观察；（2）避免金纳米的表面修饰；（3）可以在均相溶液中进行检测。特别值得注意的是这种高效、便捷的策略也适用于其他物质的检测，如葡萄糖和胆固醇。 关键词 比色法，金纳米粒子团聚，辣根过氧化物酶，邻苯二胺
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基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
Homogeneous, unmodified gold nanoparticle-based
colorimetric assay of hydrogen peroxide
Zhao Min
Department of Chemistry and Chemical Engineering, Class 08102
Abstract: An unmodified gold nanoparticle-based colorimetric assay system in homo- geneous format has been developed using hydrogen peroxide (H2O2) as a model analyte. H2O2 is added to o-phenylenediamine/horseradish peroxidase solution, and allowed to react for 10 min. Then, unmodified gold nanoparticles that serve as “reaction indicators” are added to the reaction solution. The resulting mixture color changes dramatically from red to blue. The reason is that azoaniline, a horseradish peroxidase-catalyzed oxidation product, induces the nanoparticle aggregation. Using this approach, H2O2 can be semiquantitatively determined over the concentration range of ~4 orders of magnitude by the naked eye. If the observed peak intensity at 420 nm is used for the construction of the calibration plot, hydrogen peroxide can be accurately determined down to concentration levels of 1.3×10?6 M. Compared with the conventional electrochemical protocol, this sensing system offers several important advantages: (1) ability to be monitored by the naked eye, (2) avoiding the need of surface modification of electrodes or gold nanoparticles and (3) detection in homogeneous solution. It is worthy of note that this efficient and convenient strategy is also suitable for the detection of other species, such as glucose and cholesterol.
Keywords： Colorimetric assay; Gold nanoparticle aggregation; Horseradish peroxidase (HRP); o-Phenylenediamine (OPD)
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基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
1引言
过氧化氢（俗名：双氧水）是环境分析和临床检验中的重要检测对象,也是许多氧化酶（如葡萄糖氧化酶、尿酸酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶等等）反应的产物,通过H2O2的测定可进行多种酶反应的研究。因此，过氧化氢的检测在食品检测，临床医疗，环境分析，工业及其他领域有着重要意义。现已发展了大量用于检测双氧水的方法，包括滴定法[1], 化学发光法[2-3],光谱测定法以及电化学方法[4-8]。而在电化学方法中又以酶反应生物传感器为主。近年来,通过固定过氧化物酶或过氧化物酶的模拟酶制备H2O2生物传感器得到广泛的研究,其中以HRP最为普遍[9]。然而，现有的用于检测H2O2的方法需要进一步的改进，以便简化检测步骤，改善酶的不稳定性，提高灵敏度及选择性。
纳米金粒子（gold nanoparticles）通常是指粒径范围在1－100nm 的金颗粒。从首次发现纳米金粒子到作为免疫标记物而被广泛研究经历了四百多年的历史。大约在1600年，中世纪杰出医生Parcelsus用一种植物醇提取物还原氯金酸制备“饮用金”，这就是纳米金粒子。1857年，法拉第对纳米金粒子作了系统的科学研究，发现在其中加入少量电解质后，可使它由红色变成蓝色，最终凝集为无色，加入明胶等大分子物质后可阻止这种凝集变化，他的重大发现奠定了纳米金粒子应用的科学基础。 纳米金粒子的性质:
(1)纳米金粒子的结构及稳定性
纳米金是一种带电荷的胶体溶液，因此也称之为胶体金，由金盐（氯金酸水溶液）还原成金原子后形成纳米金粒子悬浮液[10]。纳米金粒子由一个金核（金原子Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl2－），外层正离子（H＋）则分散在胶体间溶液中，依靠静电作用形成稳定的胶体溶液。较小的纳米金粒子基本是圆球形的，较大的纳米金粒子（直径大于30nm）多呈椭圆形。
影响纳米金胶体溶液稳定性的主要因素是：①纳米金颗粒间的相互吸引力，当纳米金颗粒相距很近时，这种吸引力可能导致金颗粒合并变大；②水化层的带电情况，一种溶胶的各个颗粒都带有相同的电荷，同性电荷相斥。双电层愈厚，纳米金颗粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止颗粒合并聚结，溶胶愈稳定；③纳米金胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个纳米
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基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
颗粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力，因此溶剂膜斥力是使溶胶稳定的原因之一。此外，纳米金胶体溶液的稳定存在除了本身性质所决定之外，在制备的过程中要得到高质量的纳米金溶液，需要注意的问题是：彻底净化所用的玻璃容器，所有仪器都需要经过王水浸泡后才可使用。 (2)纳米金粒子的纳米效应
当粒子粒径尺寸在1–100nm 之间时，粒子具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应。量子尺寸效应是指当粒子尺寸（体积）下降至某一特定值以后，费米能级附近的电子能级由连续变为离散能级的现象；小尺寸效应是当纳米粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长、超导态的相干长度等物理特征量相当或更小时，周期性的边界条件将被破坏，物质的声、光、电、磁、热等性质均会产生新的特征。由于量子尺寸效应和小尺寸效应，使纳米粒子展现出许多特有的性质，在催化、光吸收、生物医药、磁介质及新材料等方面有广阔的应用前景。 (3)纳米金粒子的光学性质
早在罗马时代，纳米金粒子首先作为一种色彩丰富的水溶胶以及中世纪炼金术士所说的“饮用金”被人们所认识[11]。1857 年，法拉第首先提出金溶胶中确实含有小的金属粒子这个观点[11]，并且初步研究了纳米金溶胶的光学性质。当他将纳米金溶液制成薄膜时，发现在机械压缩时薄膜的颜色发生了可逆的颜色变化，施加压力时薄膜呈现绿色，撤离压力时又变成蓝紫色，更接近红葡萄酒的颜色。他的重大发现奠定了纳米金粒子应用的科学基础。近150 年后，Mulvaney等[12]研究了金纳米粒子薄膜的光学性质，由于纳米金粒子存在显著的量子尺寸效应，因而具有特殊的光物理和光化学性质，在较宽的频段范围内存在对光的强烈吸收，从理论上解释了颜色的变化是由于粒子间距离决定的。 由于纳米金粒子表面自由电子的集体激发导致等离子体共振吸收(surfaceplasmon spectroscopy,SPS)[13]，在可见光区域产生单一光吸收谱带，特征等离子体吸收峰在510-550nm 范围变化，其最大吸收波长依赖于颗粒的大小和微粒之间的距离，大颗粒纳米金溶液偏向长波长，小颗粒纳米金溶液偏向于短波长。因此，粒径大小不同的纳米金溶液颜色有一定的差别，2-5nm 的纳米金溶液呈橙黄色，10-20nm 的纳米金溶液呈酒红色，30-80nm 的纳米金溶液呈紫红色，根据这一特点，可以肉眼观察纳米金溶液的颜色来粗略估计纳米金颗粒的大小。
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