基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
纳米科学和纳米技术的出现和最新进展，纳米粒子在生物分析中的应用打开了新的机遇，因为他们表现出独特的物理和化学相关的属性与大小量化效应[14-15]。尤其是金纳米粒子吸引了伟大的科学和技术的兴趣，因为其易于制备，具有良好的生物相容性和比较大的表面体积比[16-17]。 金纳米粒子的溶液显示出特别的颜色由于诱导的表面电子的集体振荡合适的波长，这是高度依赖可见光粒间的距离[18]。它的颗粒间出现红色距离大大高于他们的平均粒径直径，而颜色变成蓝色间的距离低于平均粒径下降[19]。金纳米粒子为基础的色度检测方法是大有希望的便捷，高效的传感器制造。日益发达的基础上，色度传感器聚合官能金纳米粒子的特定检测不同的物种，如蛋白质[20-23]，腺苷[24-25]，金属离子[26-29]，核酸[30-34]和糖[35-36]。制作这些纳米生物传感器，它通常是必须固定在特定的生物分子纳米表面上，这是费时，并导致减缓和低效的主客体的相互作用，在纳米解决方案空间位阻[37]相关的接口。虽然在非标记比色检测的基础上，已提出未修改的金纳米粒子的聚集，但它仅用于由于DNA检测的强烈吸引力的静电单链DNA的相互作用与柠檬酸涂金纳米粒子[37]。过氧化氢（H2O2）不仅是高选择性氧化酶的产物而且是食品、制药、医疗、工业和环境分析[38-40]中必不可少的中介物。因此，测定双氧水是非常重要的。因此，许多方法已经运用到过氧化氢检测中了，包括滴定法[1]，化学发光法[2-3]和电化学[4-8]。利用简单的技术去编造过氧化氢生物传感器通常是基于辣根过氧化物酶（HRP）利用其固有的酵素法的灵敏度和选择性。然而，过氧化氢分析电化学传感器的应用和发展是有限的酶变性和缺乏酶固定在电极表面的理想方法[41]。因此，现有的方法对H2O2的确定需要进一步发展，以简化测试程序，提高灵敏度和设法克服潜在的问题与酶不稳定。
本文以过氧化氢为检测体系，首次研制了一种基于辣根过氧化物酶催化氧化邻苯二胺，进而引发金纳米颗粒团聚的非标记比色传感器。我们优化了实验条件，考察了传感器的响应性能。实验结果表明：此传感器具有简易，低耗，目视比色，高灵敏度等优点，有望成为检测过氧化氢的有力工具。
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2实验部分
2.1 试剂与仪器
30%H2O2，邻苯二氨(o-phenylenediamine，上海桃浦化工厂)，HAuCl4（国药集团化学试剂有限公司）,辣根过氧化物酶（HRP, 上海雪满生物科技有限公司），柠檬酸三钠等其他试剂均为分析纯。整个实验过程所用均为电阻大于18MΩ·cm的二次蒸馏水。
紫外可见光谱通过本院紫外可见分光光度计和722型分光光度计。检测方法：将待测液装入1cm光程的比色皿中，于室温下在300-800nm波长范围内进行扫描。
2.2 纳米金的制备
用不同种类、不同剂量的还原剂还原氯金酸（HAuCl4）,可制备粒径不同的胶体金。常见的制备方法可大致分为白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸钠还原法和鞣酸-柠檬酸钠还原法。后两种方法制得的金纳米颗粒直径较为均一，因此目前较常用。还原剂的选择与制备的胶体纳米金颗粒的大小有关。一般来说，如制备金纳米颗粒直径在5~12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金酸，若欲制备直径大于12nm的金颗粒的胶体则用柠檬酸三钠还原氯金酸。在用同一种还原剂时，制备的胶体金纳米颗粒的大小还可通过调节还原剂的用量来控制。还原剂的用量的多少与制备的胶体纳米金颗粒的大小成反比。在制备胶体金溶液中要注意的问题是：彻底净化所用的玻璃容器。制备胶体金的过程是“结晶”的过程，任何污染都会干扰这一过程，引起颗粒大小不均匀，因此玻璃器皿在用前须经刷洗、酸洗，并用二次蒸级水充分淋洗，烘干后使用。各种试剂和溶液必须用二次蒸级水配制。
本实验采用柠檬酸钠还原法[42]制备纳米金。
2.3 实验方法
用10mM的柠檬酸钠配制2.0mM的邻苯二胺水溶液，取100μL该溶液于1.5 ml离心管中，相继加入5μL 0.125mg/ml 的HRP水溶液和300μL过氧化氢稀释液，在一定温度下反应10min后往离心管中加入500μL原始纳米金溶液。反应5min后即可测其紫外可见光谱。
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3 结果与讨论
3.1 基本原理
胶体金溶液的颜色很大程度上取决于颗粒间的距离，当颗粒间的距离显著大于平均颗粒直径时，溶液显红色；而当颗粒间距小于平均颗粒直径时，溶液颜色变为蓝色。虽然苯环上的氨基与金纳米颗粒之间有比较强的作用力，形成邻苯二胺-纳米金的复合物，但是可能由于邻苯二胺的两个氨基是邻位，靠得很近，两个氨基可能同时吸附在同一个金纳米颗粒上，并不会导致纳米金的团聚。因此溶液仍然呈现红色。
当溶液中含有辣根过氧化物酶HRP和H2O2时，邻苯二胺被氧化成偶氮苯，两端各有一个氨基，可以同时吸附于两个纳米金上，形成了复杂的偶氮苯-纳米金的网络结构，金纳米颗粒间的距离被拉得很近，金纳米颗粒发生团聚，从而导致溶液的颜色由红色变为蓝色，用肉眼即可进行半定量检测。同时，由于偶氮苯的生成与纳米金的团聚，溶液表现出特定的紫外可见吸收光谱。因此用简单的紫外可见分光光度计即可对H2O2进行定量分析。
图1 HRP催化氧化邻苯二铵以及过氧化氢的检测原理
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3.2 比色检测
本实验方法可直接通过目视法对双氧水进行比色检测。往5个1.5 ml 离心管中分别加入:(a) 405μL水和500μL 原始纳米金；(b)100μL 邻苯二胺的水溶液，305μL 水和500μL 原始纳米金；(c) 100μL 邻苯二胺的水溶液，5μL HRP 酶，300μL 水和500μL 原始纳米金；(d) 100μL 邻苯二胺的水溶液，5μL 水，300μL H2O2和500μL 原始纳米金； (e) 100μL 邻苯二胺的水溶液，5μL HRP 酶，300μL H2O2和500μL 原始纳米金。各管反应10 min后进行拍照，结果如图2中A图所示。可以看出，b-d 管溶液颜色与a 管中的纳米金水溶液颜色差别不大，说明b-d 管中纳米金并没有发生团聚。e 管中溶液颜色明显变为蓝色，说明e 管中的金纳米颗粒发生了团聚。即若溶液中存在邻苯二胺、邻苯二胺-HRP或邻苯二胺- H2O2时，纳米金颗粒不会发生团聚，而只有在邻苯二胺，HRP 和H2O2都同时存在时金纳米颗粒才会发生团聚。这就证明了金纳米颗粒发生团聚是因为在HRP 的催化作用下，H2O2氧化邻苯二胺，生成偶氮苯。
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图2 过氧化氢的比色法检测。A) 不同混合物的照片：(a)纳米金的水溶液；(b)含邻苯二铵的纳米金水溶液；(c含邻苯二铵及HRP的纳米金水溶液；(d) 含邻苯二铵及过氧化氢的纳米金水溶液；(e) 含邻苯二铵、过氧化氢及HRP的纳米金水溶液。B) 过氧化氢浓度分别为0.6 μM, 1.3μM, 2.5μM, 10.2μM, 20.3μM, 40.7μM, 325.6μM, 5209.6μM, 10419.2μM, 125 mM的比色法检测。（按字母顺序）
3.3 紫外可见吸收光谱
对于单分散胶体金溶液,由于单个粒子等离子体区域吸收绿光而呈现红色,但当纳米金颗粒发生团聚之后,体系等离子体共振吸收峰发生较大幅度的红移,这时聚集体在相对较长波长的光有吸收和散射，从而使颜色转变为紫红色。随着聚集体的逐渐增大,这种红移会使纳米金颗粒的特征峰值从520nm 红移至600 nm 左右,伴随着溶液的颜色由显著的红色到紫红色再向蓝色转化。 a b.51.0Absorbancecdef0.0-.5-1.0200300400500600700800Wavelength / nm 图3 不同混合物的紫外可见吸收光谱
各取500 μL 5种不同的混合液于比色皿中，在300-800nm波长范围内扫描其紫外可见吸收光谱，结果如图3所示。曲线a-e紫外可见吸收光谱分别对应如上所述的a-e五种混合液。可以看出，曲线a为纳米金水溶液的吸收光谱，其等离子体特征峰在520 nm左右，这与文献报道的结果相符。曲线b, c, d 与a比较相似，均只在波长为520nm处有较明显的吸收峰，峰的形状和强度与曲线a都比较相近，这说明混合液b, c, d 中的纳
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