基于纳米金团聚非标记比色检测过氧水
米金颗粒没有发生团聚。曲线e 为含有邻苯二胺，HRP酶和H2O2的纳米金水溶液的紫外吸收光谱，可以看出，当同时存在HRP酶和H2O2的情况下，520 nm处的吸收峰明显降低，而在420 nm和 640 nm处另外出现了两个吸收峰。曲线f为只含邻苯二胺和H2O2水溶液的紫外可见吸收光谱，只在420 nm处出现一个吸收峰。由曲线e和f可知420 nm处的峰为邻苯二胺氧化生成物-偶氮苯的吸收峰。而640 nm处的吸收峰为纳米金团聚后的吸收峰。这再一次证明了纳米金-酶反应液混合溶液颜色的变化，即纳米金团聚，是由于邻苯二胺酶催化氧化生成偶氮苯产生的。
3.4 实验条件的优化
3.4.1 邻苯二胺浓度的影响
邻苯二胺是一种还原性物质，虽然苯环上的两个氨基在空气中也会缓慢氧化，在10min内其氧化程度可以忽略不计。邻苯二胺的浓度过高，即使没被氧化，也会由于吸附在纳米金上而使纳米金表面荷电性质改变而团聚；若邻苯二胺浓度过低，则即使被高浓度的H2O2充分氧化也难以使纳米金溶液颜色发生明显变化。因此，在实验过程中要找到邻苯二胺相对合适的浓度。在这个浓度下，既能使纳米金溶液颜色变化能被肉眼所观察，又可确保其颜色的改变是由于邻苯二胺的催化氧化引起的。我们配制了几中不同浓度的邻苯二胺水溶液用于实验考察，发现在20.0mM这样一个相对较高的浓度下即使是没有H2O2的存在，纳米金溶液的颜色也会由红色变为蓝色。而在0.4mM的这样一个相对较低的浓度下，既使是用较大浓度的H2O2，纳米金溶液的颜色也无明显变化。当邻苯二胺的浓度为2.0mM时，我们发现纳米金混合液颜色的变化完全与H2O2相关，且其颜色变化能为肉眼所观察。因此在实验过程中我们用到的邻苯二胺的浓度为2.0mM。 3.4.2 HRP酶浓度的影响
另一方面，我们还考察了HRP酶浓度对纳米金溶液颜色变化的影响。往1.5ml离心管中相继加入100μL邻苯二胺，5μLHRP酶和300μL水，10min后再加入500μL原始纳米金溶液。结果发现在0.125%和0.0625%这样两个相对较高的浓度下，即使没有H2O2的存在，纳米金溶液的颜色也会由红色变为蓝色。而在0.0125%这样一个相对较低的浓度下，即使放置一个h纳米金溶液的颜色也没有明显变化,只有加入H2O2后溶液颜色才有明显变化，且溶液颜色变化的快慢和程度与H2O2的浓度密切相关。因此在实验过程
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中我们用到的HRP酶的浓度为0.0125%。 3.4.3 吸附时间的影响
我们还考察了反应时间对吸收峰强度的影响。往1.5ml离心管中相继加入100μL邻苯二胺，5μLHRP 酶，200μL水和100μL H2O2，10min后再加入500μL原始纳米金溶液。在反应1min,2min,5min,8min和10min后分别测其紫外可见吸收光谱，结果如图4所示。我们发现，随着反应时间的增加，520nm处的吸收峰强度越来越小，波长有红移的趋势。而650nm处的吸收峰强度越来越大，波长也有红移的趋势。520nm和650nm处的两个吸收峰分别是原始纳米金溶液的吸收峰和纳米金团聚后的吸收峰，因此我们知道，随着时间的延长，纳米金颗粒的团聚程度也越来越大，溶液颜色变化越来越明显。但是在反应进行10min后，溶液颜色的变化已基本稳定，且520nm处吸收峰强度变化也趋于稳定（如图4中插图所示）。因此我们选择反应的时间为10min。
图4 吸附时间对吸光度的影响（酶催化产物吸附在纳米金颗粒上）。箭头表示随着时间增加吸收峰强度的变化趋势。在波长为520nm 处，吸光度随时间的增加而减小，在波长为650nm 处，吸光度随时间的增加而增大。插图：520nm 处的吸收峰强度随时间的变化关系
3.4.4 反映温度的影响
酶的催化活性与反应温度密切相关。在相对较低的温度下，酶的反应活性相对来说也比较低，随着温度的升高，酶的反应活性会随之增强，但过高的温度又会导致酶的变
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性失活。因此选择一个合适的反应温度显得十分重要。我们分别考察了4℃，12℃，20℃，25℃，30℃，40℃，50℃和60℃下反应10min加入纳米金溶液后混合溶液的紫外可见吸收光谱，具体实验步骤如上所述。 10510095Activity ?858075010203040506070Temperature / 0C 图5温度对HRP酶活性的影响
我们发现在25℃下溶液颜色变化最明显，520nm处的吸光度趋于最小，650nm处的吸光度趋于最大。这说明在25℃下，纳米金颗粒的团聚程度是最大，即在此温度下HRP酶的活性最好。以25℃时420nm处的吸光度为标准，定义HRP酶的活性为100%，其他温度下HRP酶的活性定义为该温度下420nm处的吸光度与25℃下420nm处吸光度的比值（以百分数表示）。以HRP酶活性对温度作图，结果如图5所示。因此在实验过程中我们选择的反应温度为25℃。
3.5 传感器的响应性能
用我们提出的这种方法可以直接检测过氧化氢的浓度。为了得到标准曲线，我们配制了一系列不同浓度的过氧化氢的水溶液，浓度依次为0.6μM，1.3μM，2.5μM，5.1μM，10.2μM，20.3μM和40.7μM，记录各浓度下的紫外可见吸收光谱。如图6所示。可以看出，当过氧化氢的浓度较高时，420nm处邻苯二胺氧化产物的峰较高，650nm处纳米金团聚产生的峰也比较高。随着过氧化氢浓度的减小，这两处峰的强度也随之降低。当过氧化氢的浓度降至1.3μM和0.6μM时，所得的光谱基本上与纯纳米金溶液的峰相近，
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说明此时基本上已没有氧化产物产生。
图6含有不同浓度过氧化氢的混合溶液的吸收光谱。箭头方向表示样品中被分析物（过氧化氢）浓度的减少
以各浓度下420nm处的吸光度对过氧化氢的浓度作图，结果如图7所示。可以看出，在1.3-40.7μM的浓度范围内420nm处的吸光度与过氧化氢浓度有良好的线性响应关系。回归方程式是Y = 0.1111 log X + 0.2380，相关系数为0.9945。用这种方法对过氧化氢可以达到0.6 μM的检测限（可检测到的紫外吸光率响应）。 .45.40Absorbance.35.30.25.200.0.2.4.6.81.01.21.41.61.8Log H2O2 concentration / ?? 图7 420 nm处的吸光度与过氧化氢浓度对数的线性关系
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为考察此检测方法的重现性，按实验部分所述方法配制不同浓度过氧化氢的水溶液，每一种溶液平行反应5次，收集各次紫外可见光谱，其相对标准偏差小于6.6%.
3.6 回收率
H2O2回收率可以由标准曲线得到。配制六个H2O2水溶液样本，浓度从2.5μM变化到40.7μM不等。收集不同浓度下的紫外可见吸收光谱，根据标准曲线得到检测到的过氧化氢的浓度，结果如表1所示。其回收率定义为检出的过氧化氢的浓度与实际加入的过氧化氢浓度的比值（以百分数表示）。平均回收率为92-103% ，相对标准偏差为4.8-6.2%。这表明我们提出的这种方法能够很好地检测试样中的H2O2。
表1 H2O2检测的回收率
Sample 1 2 3 4
Added (μM)
2.5 10.2 20.3 40.7
Found (μM)
2.3 10.5 20.3 40.2
Recovery (%)
92 103 100 99
RSD (%) 6.2 5.1 5.5 4.8
4 结论
基于纳米金颗粒团聚的原理，本文研制了一种新型的过氧化氢比色传感器。在辣根过氧化物酶的催化下，邻苯二胺被过氧化氢氧化成偶氮苯，进而引起纳米金的团聚。加入的H2O2的量增加，纳米金团聚的程度也随之增大。在优化的实验条件下，用我们提出的这种方法既可肉眼半定量分析低至10 μM浓度的H2O2，也可在1.3-40.7 μM的浓度范围内对H2O2进行定量分析，检测下限可达到0.6μM。这种检测方法操作简单，检测迅速，重现性好，灵敏度高，有望成为检测过氧化氢的有力工具。
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