几种新型荧光分子探针的合成及性能研究
第1章 绪 论
1.1荧光分子探针概述
1.1.1基本概念
传感技术是现代科技的前沿技术，许多国家已将传感技术列为与通信技术和计算机技术同等重要的位置，称为信息技术的三大支柱之一。所谓传感技术，是人们为了对被测对象所包含的信息进行定性的了解和定量掌握所采取的一系列技术措施，而传感器就是完成相应传感功能的器件活装置。传感器大致可分为三种：（一）物理传感器是以外界的光、声、磁或温度等物理量为对象，并将其转变成电信号的装置；（二）化学传感器就是将各种化学物质的特性(如气体、离子或电解质溶液、空气湿度等)的变化定性或定量地转化成为电信号的传感器；（三）生物传感器是使用固定化的生物分子结合换能器，用来侦测生体内或生体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置[1]。根据所应用的检测方法，最常见、最重要的化学传感器主要有电化学传感器、生色（紫外）传感器、荧光传感器等等。
如图1.1所示，一个具有分子器件性质的化学传感器可简单地分为3个部分：（1）外来物种的识别部分(Recognition moiety)；（2）传感器在接受外来物种后将信息传输外出的报告器部分(Report moiety)；（3）中继体部分(Spacer)。它具有体积小、费用低、不需要预处理以及远距离探测等优点，而且不管是在溶液中还是在界面上，荧光信号比较容易观测及检测的下限浓度往往较低，因此受到人们青睐。另外一些化学传感器具有渗透细胞壁的功能，可以对活细胞进行非破坏性检测，从而为更好的揭示各种离子在生命过程中所起到的作用及导致的疾病机理打下基础。
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图 1.1 化学传感器的结构示意图
一般认为化学传感器(Chemical sensor)是指能连续提供其环境化学量信息的传感装置，由化学探测层与物理传感元件组成[2]。按此定义，把一次性使用或不能
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连续传感的装置叫探针(Probe)。荧光分子作为传感信号具有以下优点：最高可达单分子检测的高灵敏度、能够实现开关操作、对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨能力和亚毫秒时间分辨能力、原位检测(荧光成像技术)以及利用光纤进行远距离检测等等[3]。荧光分子经过特殊设计引入到待测体系中，能够将分子识别的信息转换成荧光信号传递给外界，从而使人与分子间的对话成为可能，架起宏观世界和微观世界联系的桥梁，具有这种功能的分子称之为荧光分子探针[4]。
荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测，这种技术的基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围。随着科学发展，荧光分子在信息传递过程中，由于受到不同的环境刺激如异构体互变、离子配位、氧化还原、光电控制的电子能量转移、弱键的形成与断裂等而发生荧光变化，可以实现荧光的开、关转换，更适合于生物微观结构的识别和标记，因而近年来荧光分子作为探针在生命科学、环境科学、材料科学、信息科学等领域得到了广泛的应用。
1.1.2荧光团的选择
荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达为荧光信号。荧光分子探针中的荧光团通过给出荧光强度的增强和减弱，以及荧光峰值波长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用。然而，目前荧光分子探针中所用的荧光团却非常有限，主要为荧光素类衍生物、多环芳烃类化合物及其他可以发荧光的有机化合物和金属配合物等。它们本身或衍生产物具有很高的荧光量子产率，但最大吸收波长和荧光发射波长多小于600 nm。因此，寻找灵敏度高、选择性好、对光稳定、量子产率高、可用于荧光分子探针的新型荧光团，对于荧光分子探针的设计是非常重要的。 1.1.2.1稠环芳烃类荧光团
以蒽、芘为主要代表的稠环芳烃类荧光团一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光分子探针研究领域里，它们作为结构最简单的荧光团经常用于基础理论的研究。特别重要的是，蒽、芘能产生激基缔合物荧光这一特征是其它种类荧光团不具备的。到目前为止，基于激基缔合物原理设计的探针，绝大多数都是以蒽和芘作为荧光团的，但是这类荧光团往往具有致癌性，吸收波在紫外区，大大限制了其作为生物荧光分子探针的应用。
化合物1是一种新型基于Hg2+诱导脱硫而设计的分子传感器[5]。该类化合物本身没有荧光或荧光较弱，加入Hg2+后，会导致其荧光显著增强或吸收光谱的变化。化合物2中多胺配体作为识别基团固定在类似蒽的荧光团上得到了一个能识
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别Hg2+的荧光探针[6]，随着的加入荧光强度降低了18倍且选择性好。说明将多胺配体固定在荧光团上对提高选择性很重要，其配位可影响分子内的电子转移反应，实现荧光分子探针的“on-off”。化合物3作为荧光分子探针实现了肉眼方法区别了Cu2+、Hg2+，其它离子对它们的检测不构成干扰[7]。Cu2+的加入使得物质激发波长红移，Hg2+的加入使其荧光强度增加。化合物4是通过2,6-吡啶二甲酸把两个乙二胺的二萘嵌苯双酰亚胺荧光团连接起来的PB-BP探针结构[8]。该探针对Hg2+有很好的选择性，它与Hg2+作用后，365 nm的荧光信号增强，而557 nm的荧光变弱。对Hg2+的检测下限为1.0×10-8 M。
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1.1.2.2萘酰亚胺类荧光团
萘酰亚胺类化合物作为一种荧光团母核，是很重要的有机功能染料中间体，已经被广泛应用于染料、颜料、荧光增白剂、荧光墨水、涂料等方面。由于其具有良好的光化学稳定性、热稳定性以及结构修饰的多样性等特点，已引起了广大科研人员的极大兴趣，在光敏感材料[9]、化学荧光探针、DNA嵌入剂、有机电致发光材料[10]等领域的研究已经全面展开。
萘酰亚胺分子的特点主要有：（1）刚性、共平面性。一般来说，荧光物质的刚性和共平面性越强，分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用越少，外转移能量损失越少，有利于荧光的发射；（2）具有较大共轭体系，使得离域π电子容易激发，从而容易产生荧光；（3）分子结构中具有推－拉电子体系，而这种体系中的电子很容易受到外界的光或者电场激发发生跃迁，产生荧光。目前国内外有关1,8-萘酰亚胺类化合物的研究主要集中在亚胺的变化和萘环的修饰上。
在内部电荷转移（ICT）理论基础上，化合物5中脂肪族叔胺氮原子用吡啶2-甲胺的氮原子替代，形成两个类似乙二胺结构的作用单元[11]。在水/乙醇混合溶液中与Cu2+形成1:1的金属－配体配合物后，475 nm处出现一个新的很强的荧光发射峰，荧光蓝移明显。它能高灵敏、高选择性定量检测Cu2+，这种传感器的显著光学性能有利于进一步拓宽对其它重过渡态金属离子的测定。在化合物中萘酰亚胺4-位的仲胺上再引入一个吡啶-2-甲基得到了新的荧光功能分子6，在pH=7.0的
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水/乙腈混合溶液中可作为Zn2+的荧光分子探针[12]。和Zn2+的作用导致与1,8-萘酰亚胺直接相连的仲胺去质子，N原子的给电子能力进一步增强，从而表现出紫外吸收光谱红移，荧光发射从537 nm红移至593 nm，并且荧光强度也有较大减弱，达到了选择性识别Zn2+的效果。化合物7在加入F-后再加入各种阴离子时[13]，可能由于F-强电负性使萘酰亚胺4-位胺基去质子，并导致分子电荷密度变化，紫外－可见吸收光谱从455 nm红移至550 nm。
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1.1.2.3碳菁类荧光团
碳菁类荧光团近年来应用在红外激光染料、非线性光学材料和生物大分子荧光标记等方面，是一类由两个杂环体系及中间次甲川链组成的染料，主要是以吲哚环和苯并噻唑、苯并噁唑或苯并吲哚等含氮杂环为骨架[14]。碳菁类荧光团的结构特点是通过单次甲基或多次甲基将两个含氮的环连接起来，形成共轭大π键。碳菁荧光团是目前核酸荧光探针中较新的，也是研究比较活跃的一类。不对称菁荧光团合成及性能测定的文献很多，此类荧光探针对不在活细胞内的少量细胞也很敏感，在水溶液中基本不会光退化，因此其水溶液可长期、连续地用于核酸测定。这些染料与双链核酸结合时（包括DNA和RNA），其荧光增强，当专门用于标记DNA时，必须先加入RNA酶进行处理，菁染料也可与寡聚核苷酸探针同时使用，以显示和定量分析细胞中的特定核酸序列[15]。
化合物29以三碳菁为荧光团[16]，N,N-二甲基吡啶为识别基团，有很好的细胞通透性、较大的最大吸收波长和荧光量子数。表现出很高的选择性和敏感性，在巨噬细胞中，该化合物能够对细胞中的Zn2+离子有很好的响应。化合物30与dsDNA结合后的荧光最大波长在520～550 nm之间，而随着染料分子中电荷的增加，荧光量子产率QF有明显的增加[17]。将染料－DNA化合物分别超声波降解不同时间，发现荧光最大波长不随DNA的链长度变化而改变，只是荧光强度随着降解时间的增加而有微弱减小。当染料与ssDNA结合后，荧光强度的下降取决于染料分子中的电荷。
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1.1.2.4卟啉酞菁类荧光团
一般情况下，卟啉和酞菁都是颜色较深、熔点较高的固体，对光和热相对稳定。它们最显著的化学性质是容易和金属离子反应形成配合物，根据金属离子价态、半径以及配位数的不同，形成的配合物也多种多样。
在卟啉或酞菁的基本结构中，周边取代的官能团可以是烷基、苯并基团、杂环等，它们主要有2个主要吸收带：紫外区的B带和近红外区的Q带，Q带受稠环个数、取代基数目的影响，一般分布于650～850 nm，如Lajolla Blue是一种硅酞菁衍生物（λem=680 nm，量子产率70%）具有很好的光稳定性，可用于荧光免疫分析中标示蛋白质。水溶性酞菁也以独特的吸收和荧光特性在生化分析中的应用正日趋广泛，其较深的色光和对蛋白质非特异性的强吸附使其被用作新型的蛋白质染色剂；较高的荧光量子产率和较大的Stokes位移（>300 nm）使其在荧光免疫分析中被用来标识抗体或在DNA杂交中作DNA探针。但是，酞菁类染料的缺点是合成中溶解度小、体积大，会影响生物分子其它性能[18]。
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化合物10与Z-DNA作用后[19]，原探针在633 nm的发射荧光蓝移至622 nm，且670 nm的荧光有所增强，而该化合物与B-DNA作用后，上述两个波长的荧光都被猝灭。其最大的优点是不会导致Z-DNA向B-DNA的转化。化合物11是冠醚
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