几种新型荧光分子探针的合成及性能研究
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。加入F-后，其乙腈溶液由绿色变成棕色，并且荧光最大波长从490 nm红移至
565 nm。化合物32是一个开关式的荧光探针[46]，可用于活神经元细胞和巨噬细胞中NO的检测。与铜离子形成的配合物不产生荧光，而当NO与配体的氨基反应后，生成有荧光的化合物，检测下限在纳摩尔级水平。 1.1.3.4环糊精类识别基团
自1891年Villers发现环糊精(CD)至今已逾百年，是继冠醚后的第二代识别基团，已经发展成为超分子化学最重要的主体之一。环糊精是由葡萄糖通过1,4-糖苷键相连形成的一类筒状化合物，其内腔疏水而外部亲水。环糊精的分子结构独特，而且易于衍生，所以可以被用来设计目的不同的具有特殊结构和高度选择性的主体分子。一般是将荧光团连接在环糊精上，在水溶液中，荧光团进入环糊精的疏水空腔，在与识别基团结合时，客体将荧光团从空腔中逐出，导致荧光变化，这类探针多用来识别中性分子。
环糊精的分子识别过程涉及到范德华力、疏水作用力、偶极-偶极、诱导偶极-偶极、静电力和氢键等多种非共价键力的协同作用。然而，母体环糊精的识别能力是有限的，因此，目前设计和合成具有功能性基团的新型环糊精衍生物作为超分子主体，探讨主-客体分子的相互识别作用规律及其功能性基团的特性已成为近年来化学、生物学和药学领域的一个新的研究热点。基于激基缔合物原理的环糊精荧光探针比较常见，例如将芘连在环糊精上的荧光探针处于水溶液中时，芘在环糊精内腔中，两个芘发射团得以靠近并在激发时形成激基缔合物，发射强烈的激基缔合物荧光。当溶液中加入新的客体分子时，能进入环糊精内腔，将芘取而代之，使激基缔合物荧光大大降低，而出现芘单体荧光。
HN.aHNnbnNHNHNHb.a = α-CD, n = 133b = β-CD, n = 0,1,2,334
化合物33是将芘荧光团通过三乙胺桥连接到氨基环糊精上[47]。其荧光强度在pH为5～10的范围内成线性，是一个较宽范围的pH荧光探针。化合物34在引入Cu2+后，主体分子对几种染料分子的键合能力得到扩展[48]。原因是Cu2+引入后主体化合物的构象相对稳定，同时发生客体与配位铜离子的静电相互作用。在pH为7.2时，主-客体间的尺寸匹配、疏水作用和范德华力决定所形成配合物的稳定性。在pH为2.0时，主客体间的静电相互作用和疏水作用成为超分子配合物形成的主要驱动力。
1.1.3.5杯芳烃类识别基团
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杯芳烃是由对位取代的苯酚与醛在碱性或酸性条件下反应得到的一类环状缩合物，是继冠醚和环糊精之后出现的“第三代”主体分子。它能与离子、中性分子形成主客体包结物，这是集冠醚(客体为离子)和环糊精(客体为中性分子)两者之长。杯芳烃的空穴大小的调节具有较大的自由度，目前已合成了4～20个苯酚单元所构成的不同环腔尺寸的杯芳烃。杯芳烃下缘的酚羟基、上缘的苯环对位及连接苯环单元的亚甲基都能进行各种选择性功能化，得到不同的衍生物，获得许多含有杯芳烃衍生物识别单元的光学功能分子。在诸多大环配体中，杯芳烃在化学传感器的灵敏度、选择性以及配位的效率上都有着独特的优点，同时由于杯芳烃的大小、电子给体的类型以及取代基的位置对于离子的选择性也有很大的影响，因而在设计时有着较大的自由度[49]。
Me2NNMe2NMe2NMe2OOOO.O2SO2SSO2NHNHHNHNSO2OOOOOOOOOONHOOOOOOOOOO.353637
化合物35是一种高选择性、高灵敏度的Pb2+传感器[50]，一次引入四个萘磺酰胺基团，大大提高了检测的灵敏度和光化学稳定性。同时由于氨基的存在，pH值对传感器有着一定的影响，在pH为5.2时的络合能力达到最佳。在515 nm和565 nm两处的荧光强度比值同[Pb2+]成正比，可用于定量检测，检测限达到10-7M。含有荧光团的化合物36在酸性条件下和碱金属K+、Rb+形成配合物时发生荧光猝灭现象[51]，而对于相同条件下的其它碱金属却未发生猝灭。这主要是因为化合物可以和K+、Rb+形成稳定的配合物。化合物37可有效地识别Cu2+，具有有很好的选择性[52]。随着Cu2+浓度的不断增大，溶液的荧光强度逐渐降低，但最大发射波长却不发生变化。更为有意义的是该荧光试剂和Cu2+形成配合物后，对于D-(+)-葡萄糖酸内酯具有很好的识别作用。最大发射波长位置没有发生变化，荧光强度却逐渐增强。
1.1.3.6其它类型识别基团
除了以上介绍的几种常见的识别基团外，还有许多其它类型的识别基团被用来开发阳离子荧光分子探针。例如，磺酰胺化合物38对Pb2+有选择络合性质，并
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引起化合物的荧光猝灭[53]。该类检测器能选择性的提取Pb2+，且提取率达到100%，在Zn2+有很好的应用前景。多羧酸类化合物39是一种新的“off-on型”分子探针[54]，和Cd2+存在下荧光增强，而且Cd2+使得其荧光有60 nm的红移。这种不同可直接用于Zn2+和Cd2+的区分。而钾盐的形式存在保证了水溶性，从而增强了实用性。
OOSNH.NHOSONMe23839NMe2KO2CKO2CCO2KCO2KNMe2OSNGluOH40CysGluGlu.
另外，在生物领域也不断发现新型的识别基团用于荧光分子探针的研究。例如，DNA(脱氧核糖核酸)可以被组合优化而产生类似酶的选择性催化功能，基于其催化剂原理得到了新型的Pb2+荧光分子探针[55]。以四肽为识别基团的Pb2+荧光分子探针40则是用对探针所处微环境的极性十分敏感的N,N-二甲基氨基萘磺酰胺作为荧光团，用一个四肽作为识别基团[56]。在同Pb2+络合后四肽的构象发生改变，因而整个分子所处的极性发生改变，进而影响到分子的荧光性质，实现对Pb2+的定性、定量检测，灵敏度可达10-8M。
1.2荧光分子探针的设计原理与检测机制
1.2.1荧光分子探针的结构特点
荧光化合物大多数表现为有机芳香族化合物或它们与金属离子形成的配合物，这类化合物在紫外光区和可见光区的吸收光谱和发射光谱，都是由该化合物的电子跃迁引起的。已知大量的有机物中，仅有小部分会发生强烈的荧光，它们的激发光谱、发射光谱和荧光强度都与它们的结构有密切的关系。
其结构有以下特点：（1）含有共轭双键体系，通常增加分子内π电子共轭体系长度可提高荧光效率并使荧光红移；（2）具有芳环或杂环。芳环越大，其荧光峰越向长波长方向移动，荧光强度往往也越强。苯、萘仅在紫外区有荧光，随着芳环的增加，它们的荧光光谱可以进入可见光区；（3）具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系。闭环可以增加分子共平面性和刚性而使荧光增强，许多本身无荧光或者荧光很弱的化合物与金属螯合产生具有环状结构的螯合物时显示较强荧光；（4）空间位阻效应的存在能破坏分子的共平面性和共轭程度，从而使荧光减弱，立体异构现象对于荧光也有显著的影响，顺式和反式同分异构体往往具有不同的荧光性质[57]。
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另外，取代基的性质对物质荧光特性和荧光强度都有很大影响。芳基上引入取代基可改变荧光的量子产率和荧光波长，通常邻、对位定位基可使荧光增强，间位定位基使荧光减弱。根据作用不同大致可分为三类：（1）增强荧光的取代基，属于这类取代基的有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR（R=-CH3，-C2H5等）等给电子基团。含这类取代基的荧光物质，其激发态的产生常常是取代基的O或N上的非键电子被激发到π*键上造成，取代基的孤对电子参与荧光分子的共轭大π键，扩大了共轭体系，使最大吸收波长和荧光发射波长比未含取代基的母体化合物的波长红移，荧光强度也有显著增加；（2）减弱荧光的取代基，如C=O, -NO2, -COOH, -CHO, -COR（R=-CH3, -C2H5等），-N=N-，卤素等吸电子基团。荧光减弱的原因则各不相同，如硝基、偶氮基能发生预解离阻止荧光的产生；重原子(如Br、I等)一般有“重原子效应”而影响系间跨越跃迁的速度使荧光量子效率降低；分子两端分别连接给电子和吸电子基团可使荧光波长发生红移并伴随强度的增强。
从化合物荧光性能与结构的关系来看，一个强荧光物质一般需要具备的特征是需要有大的共轭π键结构、刚性的结构，特别是平面结构以及较多的给电子取代基[58]。一个荧光探针分子的识别基团识别被测物后，识别信息按照某种传递机制传递给荧光团，从而产生荧光信号响应。它通常由三部分组成：识别基团、蕴涵传递机制的连接臂和荧光团。其中识别基团和荧光团分别代表着微观和宏观，也是目前研究的最广和最为成熟的两部分。传递机制则是连接微观与宏观之间的桥梁，直接决定着信号的性能，从而影响到整个识别事件的表达。对传递机制的研究也是荧光探针领域最为绚丽多彩的部分，出人意料而又引人入胜的荧光响应信号总能激发起人们对内在机制探索的兴趣，神秘的信息读取和传输过程也赋予了人们无穷无尽的想象空间。很多被分析物都可以用荧光方法测得，如阳离子(H+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+和Cd2+等)，阴离子(卤离子、羧酸根、磷酸根和ATP等)，中性分子(糖类)和气体(O2、CO2、NO等)。
因此在荧光化学传感器的设计中，一般要考虑两个部分：一是对被测物（客体）具有高选择性的荧光团的设计；二是高灵敏度识别基团的设计。另外还需要在识别基团和荧光团之间设计一种被测物与识别基团之间相互作用能迅速响应，并影响发光体发光信息变化的结构，使得体系对受测物识别的信息能够及时传递，因此还可能涉及到整个分子化学性质、空间构象等因素的影响。
1.2.2荧光分子探针的识别原理
近几年，利用荧光分子传感器，实时、原位分析过渡金属和重金属离子的研究受到了广泛的关注[59]。由于这类金属离子多数都对有机染料分子的荧光具有内在的猝灭作用，最近的许多研究多致力于设计具有金属络合诱导荧光增强的分子探针。Kimura认为理想的传感器应具有以下特征：荧光分子探针自身稳定，对某
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种金属离子高选择性、高敏感性、快速可逆响应(实时)、微米水平上原位响应并易于操作[60,61]。荧光分子探针的主要应用领域是生物、医学和环境监测，所以在水溶液中的识别更具有潜在的广泛应用价值。另外，在水溶液中通过缓冲溶液控制稳定的pH值，使识别研究的结果更可靠[62]。
通常评价荧光分子探针的性能应主要考虑其灵敏性、选择性、实时性和原位检测性能等四方面因素。其中影响灵敏性的因素有很多，如荧光分子探针与被检测物的结合强度是识别灵敏性的前提、识别信息的荧光信号转换效率同样影响识别灵敏性、荧光增强的探针一般会比荧光猝灭的探针灵敏性高等等。而选择性则主要取决于探针与被检测物特异性的结合，还与被结合的客体性质有关，专一选择性是最好的。实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快于或与被检测客体的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针；原位检测性能主要取决于分子探针与被检测体系的相溶性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体系并发出识别信号。
1.2.3荧光分子探针的检测机制
目前，在研究荧光功能分子过程中，成功的应用光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移（ICT）、能量转移(EET)和激基缔合物的形成等多种光物理原理设计合成了许多新型有效的荧光分子探针和荧光分子开关。 1.2.3.1光诱导电子转移 (Photoinduced Electron Transfer, PET)
在各种阳离子荧光分子探针中，以PET为设计原理的荧光分子探针是人们最为广泛研究的一种荧光分子探针[63,64]。相比较其他类型的化学传感器，荧光化学传感器具有检测方便快捷和灵敏度高等优点。典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团(Receptor)，通过间隔基(Spacer, 如-CH2-CH2-)和荧光团(Fluorophore)相连而构成的。
图 1.2 PET荧光分子探针的识别原理
PET荧光分子探针的识别原理如图1.2所示，PET荧光分子探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的猝灭作用，这是由于荧光团受光激发后激发态的能量足以氧化分子探针的识别基团，识别基团的最高占
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