博士学位论文
有轨道(HOMO)电子便向荧光团的HOMO转移，使得荧光团的激发态电子能够回落到原来的基态，从而阻止了荧光团的荧光发射过程。与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，氧化电位升高，使得受体的HOMO在能量上低于荧光团的HOMO，结果是会发射荧光。由于与客体结合前后的荧光强度差别很大，呈明显的荧光“关-开”过程，这类探针又被称作荧光分子开关。
NNCOO-COO-COOOONF41NF4344-NO.NOOOSSOSS.NOB-42
已知的PET荧光开关分子中，多数是以脂肪氨或氮杂冠醚作为识别基团，且分子多是以蒽作为荧光团，亚甲基或酰胺键作为间隔基连接不同的识别基团所构成的PET荧光分子探针。化合物41在甲醇中和K十络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.141。化合物42对pH不敏感[65]，其pKa被降低到2.1，它的细胞渗透性很好，在细胞内Zn2+的荧光显微成像研究获得了满意的结果。化合物43则利用识别基羧酸基团形成的空穴可以有效地螯合碱土金属Ca2+ 和Mg2+[66]。大多数PET荧光分子探针的设计是基于识别基团与客体的结合，使光诱导电子转移受到抑制，荧光团荧光恢复的原理设计的(“off-on”开关)。化合物44的识别基团为硫杂冠醚
[67]
，虽然与Cu2+有很强的亲和能力，但不同的是配位后产生从荧光团到金属离子根据离子参与的电子转移反应原理设计出的化学荧光探针的优点主要表现在
的PET过程，导致荧光猝灭。这是PET过程的另一种表现形式，即“on-off”开关。 以下方面：（1）具有高的灵敏度，检测限可以达到单个纳米数量级别；（2）具有良好的“off-on”性，信号变化大且易于识别；（3）快速响应，时间分辨率可达10-7秒；（4）识别基团与荧光团单独分离的构建体系将更加方便的通过化学或物理手段来进行修饰；（5）高的选择性，由于涉及到能级匹配的问题，PET过程对离子的识别更专一[68,69]。
1.2.3.2分子内共轭电荷转移 (Intramolecular Charge Transfe, ICT)
基于ICT过程设计的分子是具有共轭结构的分子内电荷转移化合物，在分子的两端存在着推－拉电子效应。典型的ICT荧光分子探针是由荧光团与识别基团直接相连构成[63,64]。如图1.3所示，在荧光团的两边分别连有吸电子基团(电子受体)与给电子基团(电子给体)，并且给电子基或吸电子基本身又充当识别基团或识别基团的一部分。
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几种新型荧光分子探针的合成及性能研究
图 1.3 ICT荧光分子探针的识别原理
当发生光的激发作用时，就会发生从荧光团到识别基团的电荷转移，同时产生的偶极距变化导致体系微环境的改变，一般用Stokes位移来描述。例如，当阳离子与荧光分子的电子给体一端发生作用时，阳离子减弱了电子给体的给电子能力，降低了体系共轭程度，吸收光谱蓝移，摩尔吸光系数减小；而当阳离子与电子受体一端相互作用时，将提高电子受体的接受电子能力，共轭程度加强，吸收光谱红移，相应的摩尔吸光系数增加，同样，荧光光谱的变化遵循和吸收谱图一样的规律，而且荧光量子效率和荧光寿命也都将发生变化。一般情况下，ICT荧光分子探针对荧光强度的影响不如PET探针那么显著。
典型的ICT荧光探针的荧光团是一个强的推－拉电子共轭体系，即通常所说的D-A型分子。共轭体系受光激发后会产生从电子给体到电子受体的电荷转移（ICT）。当络合了被分析物之后，给电子部分或吸电子部分的电子能力被改变，整个体系的π电子结构重新分布，形成不同的基态，从而带来吸收光谱、激发光谱以致荧光光谱的移动，通常被定义为“主动型”ICT荧光探针。
NMe2FNONOO.OONONOOOOO46[70]
BFNONCF3OOOOO47ONOO48O.OO45
化合物45是典型的ICT荧光探针，氮杂冠醚既是推－拉电子体系中的电子给
体，又是分子探针中的识别基团。当冠醚与Ca2+络合时，由于金属离子的吸电子效应，降低了氮杂冠醚中氮原子的给电子能力，发生荧光蓝移并增强。多数ICT荧
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光分子探针在结合金属离子后，荧光强度的变化不如PET分子探针明显，但化合物46是一个特例。分子中二吡咯甲基硼和氮杂冠醚均为电子给体，与Li+络合后荧光强度增大90倍，而与Mg2+络合后荧光强度增大2250倍[71]。化合物47与Ca2+结合后吸收光谱红移，荧光略有下降[32]。这是由于在键合金属离子后，一种类似羰基氧的构型促进了荧光团向苯并冠醚的电荷转移。识别基团是电子受体的ICT荧光探针，如化合物48分子中二甲氨基与氮杂冠醚均为电子给体[72]。当冠醚与Ca2+结合后，冠醚的吸电子能力增强，使整个体系成推－拉电子体系，荧光发生红移。
在ICT中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移(Twisted intramolecular charge transfer, TICT)。即具有推－拉电子共轭体系的荧光分子中，如果给电子基(如二甲亚胺)通过可旋转的单键与荧光团相连，当荧光团被光激发时，由于强烈的分子内光诱导电荷转移，连接电子给体与荧光团的单键会发生扭转，使与芳环共平面的电子给体扭转为正交状态。原来的共轭体系被破坏，部分电荷转移成为完全的电子转移，形成TICT激发态，原有的ICT荧光则猝灭。
NCN.CNCNNON49NOO50ONHHN51HNO52ONOO.
TICT态往往无荧光或者发射非常弱的长波长荧光，也有时出现ICT与TICT双重荧光现象[73]。化合物49是典型的双荧光的TICT荧光分子探针[74]，以该化合物发展的衍生物被广泛地用于TICT双荧光现象的各种研究中[75,76]。化合物50表现为双重荧光[77]，短波发射带是局部激发态产生的，长波发射带来源于TICT态。与阳离子结合后，由于氮杂冠醚与阳离子的相互作用，长波吸收带强度下降。化合物51表现出非常特殊的三重荧光[78]，第三重荧光的产生取决于溶剂、pH值和键合阳离子的微扰作用。化合物52被光激发时TICT态是无荧光的[79]，当络合H+和Ag+时，这些离子抑制了没有荧光的电荷转移TICT态的形成，荧光就被恢复。 1.2.3.3单体－激基缔合物 (Monomer－Excimer)
单体－激基缔合物是利用激发缔合物的形成和破坏引起的荧光变化来判别被测物是否被识别。形成激基缔合物和激基复合物的条件是：分子具有平面性，相互间距离达到大约3.5×10-10 m；在溶液中分子有足够的浓度；分子间的相互作用是相互吸引的等。荧光团间的距离是激基缔合物的形成和被破坏的关键，可以利用
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分子间作用力改变两个荧光团之间的距离。激基缔合物与激基复合物可以是二元络合物，也可以是一个激发态分子与二个基态分子生成的三元激基缔合物。
图 1.4 单体－激基缔合物的工作原理
如图1.4所示，单体－激基缔合物的形成原理是：一个激发态分子以确定的化学计量与同种或不同种基态分子因电荷转移相互作用，而形成的激发态碰撞络合物分别称为激基缔合物和激基复合物。激基缔合物或激基复合物形成时，其发射光谱不同于单体，表现为一个新的位于长波方向强而宽的、无精细结构的发射峰
[64]
。双荧光就是在单体的荧光之外还可以观察到一个激基缔合物发出的位于长波
方向、无精细结构宽的发射峰。单体、激基缔合物之间荧光强度的比例和分子的流动性以及微粘度有关[80]。
芘、萘、蒽等平面形的高度离域的大π键电子共轭体系荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被用于此类探针中。这类荧光开关已经广泛的被用于生物体系来研究核酸、磷脂以及小肽等在生理条件下的构型和活性变化。
OOO.OONOONOOO5354OHNOOOO55OONHO.
化合物53具有双芘荧光发色团[81]，氮杂冠醚络合K+或Ba2+后，荧光强度增大，同时单体/激基缔合物的荧光强度比发生变化。化合物54的醚链金属配位形成类冠醚状，改变了两个芘荧光团的位置，导致单体和激基复合物荧光发生变化[82]。与Ca2+和Cd2+作用时两个芘分子被拉远，激基复合物荧光下降，单体荧光增加。而有意思的是与Cu2+作用时两个芘被拉近，单体荧光下降，增加激基复合物荧光，并
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伴随着波长的蓝移。化合物55则是第一个利用调控静态及动态缔合物荧光原理设在乙腈溶液里既可以发出385 nm的单体荧光也能发出482 计的氟离子荧光探针[83]，
nm的激基缔合物荧光，但随着氟离子的加入，482 nm的激基缔合物荧光会蓝移到470 nm处。
1.2.3.4荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)
荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光团中，当能量给体荧光团D与能量受体荧光团A相隔的距离远大于D-A的碰撞直径时，只要D与A的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说D的发射光谱与A的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从D到A的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移 (甚至相距远达70-100 ?)。当D-A发生能量转移时，除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列[84]。
图 1.5 基于FRET原理的Ca荧光探针
2+
如图1.5所示，分别以蓝色荧光或黄色荧光蛋白作为能量的给体和受体，Ca2+
的结合能够加强荧光蛋白间的能量共振转移，从而使得长波荧光增强。FRET类型荧光分子探针近年来广泛的应用在生物大分子的动态分析中。生物大分子不仅结构复杂，而且多变，用X-射线衍射法或NMR法都不能满足生物大分子的多样性和动态研究的要求。当生物功能大分子中引入D-A荧光团后，观察二者的能量转移可以间接检测功能激活前后的结构变化[85]。其中最有代表性的是Tsien等研究出的Ca2+荧光探针[86]。
ONHClOOOH56OOOPOOHNHCOOHHNONONH2HOOO57
化合物56是一个检测磷酸二酯酶活性的荧光探针[87]，其能量供体和受体分别是香豆素和荧光素类荧光染料。化合物本身发生能量共振转移，主要发射荧光素的荧光。当磷酸二酯被磷酸二酯酶水解后，香豆素和荧光素分离，FRET停止，以
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