潍坊医学院硕士学位论文
四、正文 （一）前言
血管内皮是保护血管形态和功能的一层生理性屏障，也是机体最大的
内分泌、旁分泌组织系统。内皮细胞所分泌的血管活性物质包括：内皮素
-1(ET-1)、细胞间黏附分子(ICAM)，一氧化氮(NO)、内皮衍生超极化因子
(EDHF)等等，在维护血管结构和功能，调节内环境稳定等方面起着重要的
作用。这些扩血管物质（NO）与缩血管物质（AngⅡ）失衡导致了血管内
皮的损失。大量研究表明，血管内皮功能损伤是多种血管病变进程中最为
重要的始动环节之一。
血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自
分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症
反应等功能。NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶（eNOs）作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活
鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血
小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。
然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子
减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件
的发生。
（二）材料与方法
1实验材料
1.1主要仪器和器材
250-500透明动物加压仓 501型超级数显恒温水浴 上海701所杨园医用氧舱厂 上海浦东跃欣科学仪器厂 SW-CJ-IF型超净工作台 德国Leica公司 Leica020-519.010光学显微镜 德国Leica公司 5
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5810R低温高速离心机 德国Eppendorf公司 摄像及FR-988生物显微图像分析系上海复日科技有限公司 统 SmartScape2002生物图像分析软件 上海复日公司 MTFG-A通风柜 深圳医疗器械公司 微量可调移液器 法国Gilson公司 THZ-C恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂 MLS-3020高压蒸汽消毒锅 日本三洋电器公司 EL×800酶联免疫检测仪 美国Biokit公司 EL×800BioelisaReader 美国Bio-TekInstruments POLARstarmicroplatereader 德国BMG公司 DL-360超声波仪 浙江石浦海天电子仪器厂 Milli-Q去离子水制备仪美国Millipor有限公司 AB104-N精密电子天平Delta320电子PH计 美国MettlerToled有限公司 美国MettlerToled有限公司 电子天平 上海第一天平厂 电子摇床 上海离心机研究所 THZ-C 恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂 水浴锅 上海医疗器械七厂 Incucell55型温箱 德国Incucell有限公司 DK-8A型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司 DK-8D型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司 超低温冰箱 美国公司 LKB-Ⅲ型超薄切片机 德国Leica公司 CM1900恒温冷冻切片机 德国Leica公司 微波炉 Galanz公司 -70℃冷柜 HarrisManufacturing公司 干热消毒柜 StuartScientific 2.试剂及药品
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硝普钠 美国Sigma公司 一氧化氮检测试剂盒 碧云天生物技术研究所 甲苯胺蓝 中国医药集团上海化学试剂公司 InSituCellDeathDetectionKit 瑞士Roche公司 Caspase-3/CPP32FluorometricAssay美国BioVision公司 Kit Ant-nitrotyrosine：兔抗鼠 美国Upstate公司 TTC 中国医药集团上海化学试剂公司 多聚甲醛 中国医药集团上海化学试剂公司 NaCl 上海生化试剂一厂 NaH2PO4.2H2O 上海生化试剂一厂 Na2HPO4.12H2O 上海生化试剂一厂 考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒 南京建成生物科技公司 蛋白酶抑制剂 康成生物有限公司 甲醛 中国医药集团上海化学试剂公司 二甲苯 中国医药集团上海化学试剂公司 中性树胶 中国医药集团上海化学试剂公司 乙醚 中国医药集团上海化学试剂公司 30%H2O2 中国医药集团上海化学试剂公司 无水乙醇 中国医药集团上海化学试剂公司 工业氮气 上海江南气体公司 工业氧气 上海江南气体公司 3.主要试剂的配制
（1）0.9%生理盐水 NaCl9g ddH2O1000ml 混匀后高温高压消毒备用 （2）硝普钠 7
硝普钠0.3g 潍坊医学院硕士学位论文
0.9%生理盐水 10ml 溶解后振荡，用时振荡 （3）一氧化氮标准品NaNO2 在1ml中取50ml，用0.9%的生理盐水稀释标准品。 二实验方法
本研究在以大量硝普钠临床用药观察记录为研究依据。运用数理统计
学处理：结果统计采用SPSS11.0统计软件分析，数据均采用X±S表示，组
间差异用单因素方差分析，差异显著者用SNK-q检验进行比较。P<0.05为
差异有统计学意义。
（1）内皮细胞VCAM-1mRNA表达的检测
生长状态良好的内皮细胞分别用IL-lα(10ng/mL)、IL-lα(10ng/mL)+SNP(10-4
mol/L)刺激6h，消化收集细胞，按异硫氰酸胍一步法提取总RNA。紫外分光
仪定量，每组取30μgRNA上样电泳，用α32P-dCTP(比活度3000Ci/mmoL)标记的cDNA探针杂交，洗膜后-70℃压片24h，常规显影定影后，洗脱液处理尼
龙膜，α32P-dCTP标记的β-actin为探针，再次杂交，以检测上样RNA的完整性
与加样的准确性。
（2）内皮细胞膜表面VCAM-1表达的检测
细胞ELISA,接种于96孔板、生长状态良好细胞，换含2üS的M199培养过
夜后，用含5üS的M199培养，分为下列各组：IL-α(l0ng/mL)，IL-lα(l0n
g/mL)+SNP(浓度分别为10-5、5×10-5、10-4mol/L)，作用6h。IL-lα(10ng/mL)，
IL-lα(10ng/mL)+SNP(10-4mol/L)，分别作用2、6、12h。上述过程结束后，弃
去培养液，PBS+0.05%Tween20清洗，0.25%的戊二醛固定20min，1%的脱脂
奶粉37℃封闭2h，清洗后加入50μLVCAM-l抗体(l:5000)，4℃过夜，清洗，加
入50μL生物素标记抗鼠抗体(l:8000)，37℃，1h后清洗，加入50μL新闻和素
标记的辣根酶(l:8000)，37℃温育1h，清洗后加入100mL过氧化物酶底物，室
温显色20min后加入50μL4NH2SO4终止反应，结果以酶标仪490nln下的光密
度值(A)表示。
流式细胞仪检测，生长状态良好的内皮细胞换含2üS的M199过夜后，用
含5üS的M199培养，其中实验组分别加入IL-lα(10ng/mL)、IL-lα(10ng/m
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L)+SNP(10-4mol/L)，孵育6h后胰酶消化，PBS收集细胞，离心去上清，用1：
100稀释的抗VCAM-1抗体重悬细胞，4℃，60min后，10倍量PBS重悬细胞，
离心去上清,加入荧光素标记的1:100稀释的二抗，4℃，60min后，10倍量PB
S重悬，离心去其上清，0.5mLPBS重悬细胞，流式细胞仪检测其平均荧光强
度。
（3）胃蛋白酶消化法测定细胞胶原合成
将样品静息的HVSMC加入含有所需药物和3H-脯氨酸(74kBq/ml)的培养液
(1ml)，于37℃培养24h后收集各孔培养液加入试管中，然后依次加入25μLl5mol/L醋酸，25μL胃蛋白酶，50μL未标记的脯氨酸，混匀后于4℃静置3h，再
加入250μL4℃预冷的1.2mol/L过氯酸，反应2h后，将反应液中未被消化的胶
原蛋白收集，进行液闪测定，以检测培养基中胶原蛋白的含量。细胞移出培
养板后，收集进行液闪测定，以检测细胞内胶原的含量，总胶原生成量为培
养液和细胞内胶原生成量之和。另以相同的培养条件培养细胞，计算各组每孔细胞的数目。
（三）结果
研究发现，硝普钠对血管内皮有损伤作用。硝普钠对人血管平滑肌细
胞合成胶原的抑制作用，抑制白介素-1诱导血管内皮细胞粘附分子-1的表
达，对血管平滑肌钙激活钾通道具有影响，对血小板聚集有一定抑制作用。
硝普钠血管扩张的作用机制：硝普钠对细胞作用的研究很少。它直接作用
于血管平滑肌。类似于亚硝酸盐作用，血管扩张作用主要是“铁-亚硝基”基团
的作用。比亚硝酸类作用强，持续时间短，对其他平滑肌作用极小，Poge等
发现在明显降压剂量硝普钠时，对子宫、十二指肠平滑肌无影响。John，on报告只在松弛血管平滑肌浓度100倍时，对子宫平滑肌才有影响，而对动物离
体心肌则无影响。故对心肌无松弛作用。对中枢神经或自律神经无影响。扩
张血管作用亦不是通过中枢或自律神经起作用。Page和Johnson等证明这些效
果通过分子本身起作用，而不是通过它的代谢产物硫氛酸盐或佩化物起作
用。它是唯一作用于血管平滑肌的药物。这在临床上有很大应用价值。
大量临床研究和应用表明，硝普钠对血液动力、肾功能及冠状动脉流量有直接影响。
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