火腿中肌肉磷脂酶的纯化其性质研究
国外一些研究者认为，在干腌火腿生产过程中，中性脂肪变化很小，而磷脂是脂肪水解的主要底物。我们对发酵干火腿加工过程中的脂肪水解状况进行了分析，也证实了这一观点，因此磷脂水解酶成为了研究干腌火腿脂肪水解机理的关键。
本研究利用阴、阳离子交换、亲和层析等多种纯化手段相结合获得了2种电泳纯的磷脂水解酶。由于某些脂酶也具有水解磷脂的能力，我们首先需要弄清楚本研究中以磷脂为底物获得的磷脂水解酶是属于脂酶还是磷脂酶？如果是磷脂酶，和已从其它组织中纯化出来的磷脂酶有什么关系？另外，腌制剂、加工工艺条件等对该酶活有什么影响？为此，本研究对已纯化的磷脂水解酶的基本性质进行了鉴定，旨在为发酵干火腿生产过程中与脂肪水解氧化等有关的风味化合物的产生机理及其控制提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 磷脂水解酶的分离
按汪家政等（2002）方法进行。 1.2 磷脂水解酶活性的测定
用同位素标记底物法对纯化的酶活进行测定 具体操作流程：
0.2 ml 粗酶液 + 5 μl磷脂底物
反应（37℃, 20分钟）
冰浴并向反应体系中加入2 ml甲苯、三氯甲烷和甲醇的混合物
（1:0.5:1.2，v/v/v）
使反应终止。加40 μl浓度为1mol/L的NaOH溶液，确保碱性体系
2,000×g 离心10 min
取0.2 ml上层无机相于闪烁瓶
加入4 ml 闪烁液，混匀 用液闪仪测量放射强度
1.3 磷脂水解酶的纯化制备 纯化流程如图所示：
浓缩粗酶液
DEAE-Sephacel阴离子交换层析
Blue-sepharose 6 F.F. SP-sepharose F.F.阳离子 染料亲和层析 交换层析
Heparin-sepharose CL-6B Heparin-sepharose CL-6B
亲和层析 亲和层析
纯化的磷脂水解酶１ Blue -sepharose 6 F.F.
染料亲和层析
纯化的磷脂水解酶２
（所有步骤均在4℃下操作。以大豆磷脂为底物监测每步骤的总活、比活、纯化倍数、收率。同时，利用SDS-PAGE对纯化过程中蛋白的变化进行监测）
1.4 磷脂水解酶的性质鉴定
（1）SDS-PAGE电泳法测定酶的分子量 （2）动力学测定
配制不同浓度的底物，在pH 8.5，40℃的条件下，测定磷脂水解酶的反应初速度。
（3）水解4-methylumbelliferyloleate 荧光底物活性
以4-methylumbelliferyloleate为底物检测磷脂水解酶的水解活性。具体方法如下：反应混合物包括0.2 ml酶液，0.1 ml 1mM 4-methylumbelliferyloleate和2.7 ml反应buffer（220 mM Tris-HCl,含5 mg/ml 牛血清蛋白和10 μg/ml heparin，pH为8.0）。 在37 ℃保温45分钟后添加0.5 ml的1 N盐酸溶液使反应终止。荧光的测定采用RF－5000 荧光分光光度计，激发波长/放射波长为328/470 nm，做4个重复。单位酶活U定义为在37℃释放1 nmol 4-methylumbelliferone/h, 比活表示为U/g蛋白，蛋白的浓度用Lowry法（1951）测定。
（4）气相色谱法判断A1、A2活性
采用高纯度的单一磷脂（1-棕榈酸，2-花生四烯酸卵磷脂，Sigma）为底物，40℃反应20分钟后加入2 ml氯仿－甲醇混合物（2:1, v/v）
提取未反应完的磷脂及反应生成的游离脂肪酸，然后分离游离脂肪酸，甲酯化后进气相色谱分析。 （5 ）磷脂水解酶的同源性分析
用胰蛋白酶对磷脂水解酶1和2进行胶内酶解，同时捕捉肽段，通过基质辅助激光解析飞行时间质谱法得到肽质量指纹图谱，用AutoMS-Fit软件查询NCBInr数据库，将所得的肽质量与数据库中理论肽质量相配比。
（6）温度对磷脂水解酶2活性的影响 （7）pH对磷脂水解酶2活性的影响
（8）各种激活剂和抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响 （9） 金属离子对磷脂水解酶2活性的影响 （10）腌制剂对磷脂水解酶2活性的影响
2 结果与讨论
2.1 磷脂水解酶的纯化制备
（一 ）DEAE-Sephacel阴离子交换层析
A2802.521.510.5洗脱时间(min)0501001502002503009080701 2 3 4 6050403020100
002040收集管号电导酶活60UV80图1 DEAE-Sephacel阴离子交换层析
将粗分离获得的浓缩粗酶液用buffer A进行透析，上
酶活(units/ml)电导(ms/cm)DEAE-Sephacel阴离子交换柱，并对存在蛋白的各收集管以磷脂为底物进行磷脂水解酶活性测定，结果见图1。在低离子强度和高离子强度分别检测到1个具有磷脂水解酶活性的峰，说明在猪后腿中至少存在两种磷脂水解酶。分别收集2个活性峰进行后续的分离纯化操作。为了描述的方便，本实验中将低离子强度下洗脱下来的蛋白峰中所含的磷脂水解酶简称为磷脂水解酶1，高离子强度才可洗脱下来的简称为磷脂水解酶2。
利用SDS-PAGE电泳技术，对收集到的活性峰进行电泳分析（图2），结果发现，大部分蛋白仍然存在于低盐峰，高盐峰中蛋白种类虽多，但大多数都是小细带。
此外，由图1可知，低盐峰由3个蛋白峰所组成。事实上，这3个峰的收集液感官差别很大：峰1的收集液为白色乳浊液，可能含有大量的低盐不溶性蛋白；峰2为澄清透明的溶液；峰3为红色溶液。对后2个具有磷脂水解酶活性的低盐蛋白峰分别进行SDS-PAGE电泳，结果见图3。从电泳图可以看出，这2个峰的蛋白差异很大，考虑到这2个峰中可能存在的不是同一种磷脂酶，故分开收集。但前3个峰之间存在很大程度的重叠，所以收集到的未发生重叠的峰2和峰3组分的量非常少。
泳道 A B C A B
图2 DEAE-Sephacel阴离子交换后电泳图谱
A: 粗提液；B:峰4；C:峰2+峰3 图3 DEAE-Sephacel阴离子交换后电泳图谱
A: 峰2；B:峰3