（二） 磷脂水解酶１的进一步纯化
（1）磷脂水解酶1的SP-sepharose F. F.阳离子交换层析
将上述DEAE-Sephacel阴离子交换层析后收集到的峰2部分，浓缩后，对20 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）进行透析，透析后的样品上SP-sepharose F. F.阳离子交换层析柱，结果显示，高离子强度时洗脱下来的是活性峰（图4）。
0100洗脱时间(min)20030021.81.61.41.210.80.60.40.20020电导40收集管号酶活60UV80400706050403020100
A280
图 4磷脂水解酶1的SP-sepharose F. F.阳离子交换层析
（2）磷脂水解酶1的 Heparin-sepharose亲和层析
A280图4 磷脂水解酶 1 的sp-sepharose F.F. 阳离子交换层析 洗脱时间(min)032.521.510.505010015020025030035080705040302010005101520收集管号电导酶活253035
UV图 5 磷脂水解酶1的Heparin-sepharose亲和层析
酶活(units/ml)电导(ms/cm)60酶活(units/h)电导(ms/cm)上述SP-sepharose F. F. 阳离子交换层析中的活性峰，透析后上Heprin-sepharose亲和层析柱。结果表明（图5），当洗脱缓冲液的电导为15 ms/cms时，即NaCl浓度约为150 mmol/L时，出现1个活性峰。由于洗脱液中没有加肝素，说明该磷脂水解酶和肝素之间是非特异性结合，此时肝素亲和层析柱实质上相当于1个阳离子交换柱。
（3） 磷脂水解酶１的Blue-sepharose 6 F. F.染料亲和层析
050洗脱时间(min)100150200100908070605040302010005101520收集管号电导酶活25UV3035
A2800.40.350.30.250.20.150.10.050
图 6磷脂水解酶1的 Blue染料亲和层析
收集肝素亲和柱的活性部分，进行Blue-sepharose 6 F. F. 染料亲和层析，在电导为8 ms/cm左右时得到1个活性峰（图6）。SDS-PAGE电泳结果表明（图7），这时活性峰的前几管中基本上只存在1种蛋白，即得到了电泳纯的目的蛋白－磷脂水解酶1。 对磷脂水解酶1的分离纯化过程进行总结（表1）：
酶活(units/ ml)电导(ms/cm)
表1 磷脂水解酶1的纯化表
匀浆粗提酶液 DEAE阴离子 SP阳离子 肝素亲和 Blue染料亲和
总蛋白（mg） 总活（unit） 比活（unit/mg）
3550 320 223 28 0.3
29110 13540 11400 2607 298
8.20 42.31 51.12 93.11 993.33
纯化倍数
1 5.16 6.23 11.35 121.14
收率 (%) 100 46.51 39.16 8.96 1.02
Kda
97 66 45 36 20.1 14.2
泳道 A B C D E
图 7 磷脂水解酶1不同纯化阶段的 SDS-PAGE图谱 （三） 磷脂水解酶2的进一步纯化
A: 粗提液； B：DEAE-Sephacel柱洗脱下的活性峰2； C: Sp-Sepharose F.F.后收集的活性部分
Heparin-sepharose CL-6B后收集的活性部分；E: Blue -sepharose 6 F.F.后收集的活性部分； （D1：）磷脂水解酶2的Blue-sepharose 6 F. F.染料亲和层析 F: 低分子量蛋白标准 分离胶浓度: 15%
收集DEAE阴离子交换层析中高盐活性峰的主要部分，通过Blue-sepharose6 F. F.染料亲和层析，并对各收集管进行活性测定。结果表明（图8），活性峰存在于在低盐峰的后半部分，由于这部分蛋白浓度相对比较低，因此磷脂水解酶2的比活得到了很大程度的提高。
A28001.61.41.2150洗脱时间(min)100150200908070605040302010005101520收集管号电导酶活25UV3035
0.80.60.40.20 图8 磷脂水解酶2的 Blue-sepharose亲和层析
（2 ）Heparin-sepharose CL-6B亲和层析
洗脱时间(min)
0.30501001502008070酶活(units/ml)电导(ms/cm)
A2800.250.20.150.10.056050403020100051015收集管号电导酶活20UV2530
0图 9磷脂水解酶2的Heparin-sepharose CL-6B亲和层析
为进一步纯化，收集Blue-sepharose 6 F. F. 染料亲和层析柱的活性峰，进行Heparin-sepharose亲和层析。低盐部分的第2个蛋白峰为活性峰（图9），SDS-PAGE电泳结果表明（图4-10），这时活性峰的前几管中只存在一种蛋白，即得到了电泳纯的目的蛋白－磷脂水解酶2。
酶活(units/ml)电导(ms/cm)
泳道 A B C D E F
kDa 97.0 66.0
45.0
36.0
图 10 磷脂水解酶2不同纯化阶段的 SDS-PAGE图谱
A: 粗提液； B：DEAE-Sephacel柱洗脱下的活性峰2； C: Blue -sepharose 6 F.F. 后收集的活性部分；
D-E：Heparin-sepharose CL-6B后收集的活性部分； F:低分子量蛋白标准 分离胶浓度: 9%;
对磷脂水解酶2的分离纯化过程进行总结（表2）：
表2 磷脂水解酶2的纯化表
匀浆粗提酶液 DEAE阴离子 Blue亲和 肝素亲和
总蛋白（mg） 总活（unit） 比活（nit/mg）
3550 410 30 1.2
29110 16605 10836 2223.84
8.2 40.5 361.2 1853.2
纯化倍数
1 4.94 44.05 226.00
收率（%）
100 57.04 37.22 7.64
这部分内容直接列出了最终的纯化方案。事实上，确定最终方案之前经过了大量的条件筛选实验，包括层析填料的种类、洗脱液的种类、pH、离子强度以及层析顺序等。本文不进行一一赘述，但简单说明层析填料的选择：1) 凝胶过滤又称分子筛是一种利用分子量的差异分离纯化蛋白质的重要方法之一，Audley等人只通过Sephadex