G-50一步柱层析就从鱼肌肉中获得了分子量为14kD的纯的磷脂酶A，在蛇毒（张维文等, 2000）磷脂酶A2的分离纯化工作中，分子筛也起到了至关重要的作用。但分子筛Sephacryl S100 在本实验中表现出较差的分离效果，整个洗脱过程都能检测到磷脂水解酶活性的存在；SDS-PAGE电泳结果也显示，最先流出的洗脱液和最后流出的洗脱液中蛋白质条带的差别很小，这说明目的蛋白之间以及目的蛋白和杂蛋白之间的分子量差异不足够大，因此不适合采用分子筛法从猪骨骼肌中分离纯化磷脂水解酶。2) 本研究中比较了2种阴离子交换层析填料（DEAE Sephacel和DEAE-Sephadex A50）的分离效果。结果显示，DEAE Sephacel对低盐峰的分离效果较好，而DEAE Sephadex A50对分子量为66kDa的磷脂水解酶的富集效果更佳，但DEAE Sephadex A50在高盐洗脱时性质不稳定，所以综合考虑选用DEAE Sephacel。3) Hazen等（1990）从犬心肌胞液中纯化磷脂酶A2时采用羟基磷灰石作为填料获得了良好的分离效果，本研究也进行了尝试，但纯化效果不是很理想且该填料柱流速极低，因此没有采用。4)过Con A Sepharose层析柱时，目标蛋白没有被吸附，说明目标蛋白不具有糖侧链。
3.2 磷脂水解酶纯度和分子量的鉴定
kDa 94.0 66.2 45.0 36.0 29.0 20.1 泳道 A B C D E 图11 纯化的磷脂水解酶ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳
A:低分子量蛋白标品; B: 经还原处理后的纯化磷脂水解酶1; C: 非还原处理的纯化磷脂水
解酶1；D：非还原处理的纯化磷脂水解酶2；E：经还原处理后的纯化磷脂水解酶2
SDS-PAGE结果见图11。经染色后,样品在还原和非还原条件下均为1条带,说明样品较纯。以低分子量蛋白标品做标准曲线，根据样品在还原条件下电泳条带的相对迁移率,通过标准曲线计算出磷脂水解酶1的分子量为37.2 kDa，磷脂水解酶2的分子量为65.8 kDa。磷脂水解酶2在非还原条件下泳动速度较慢,电泳条带位置也相应比较靠后,Tsai等（1995)也曾报道蛇毒磷脂酶A2在非还原条件下会发生聚集或泳动较慢的现象。 3.3 磷脂水解酶的动力学测定
从图12和图13可以看出，磷脂水解酶1和磷脂水解酶2的动力学曲线非常相似，在底物浓度低于2 mmol/L时，酶活缓慢增加；而当底物浓度大于2 mmol/L时，酶活剧增；但超过4 mmol/L时，酶活不再增加即底物浓度达到饱和。磷脂水解酶不符合标准的动力学曲线，1/V和1/S不呈直线关系，无法用双倒数法求得Km值和Vmax值。这可能是脂酶和磷脂酶所特有的形式，因为他们的反应速度不仅取决于底物浓度，底物的构造/排列方向对酶活性的发挥也有着及其重要的影响（Verger,1980）。当磷脂溶液的浓度达到最小胶束浓度（critical micellar concentration, CMC）时，磷脂分子将定向排列形成胶束，这种定向排列有助于酶和底物的相互接触，相当于提高了底物的有效浓度从而使酶活得到大幅度的提高（Verger, 1980）；另一个原因是当磷脂酶A与单层或分散的底物结合时，其构象几乎没有变化，酶活性很低，但与聚集的分子结合时其三维构象发生变化，形成易变螺旋，酶活性很高(Gurr & Harwood, 1991)。曾经证明，使用胶束状态的底物时胰脂酶和磷脂酶A2的水解活性比单体底物时高103-104倍（Volwerk et al., 1982）。
70反应速度（nmol/h）605040302010002底物浓度（mM)46
图12 磷脂水解酶1的动力学曲线 40反应速度（nmol/h)3020100-100123底物浓度（mM)456
图13 磷脂水解酶2的动力学曲线
3.4 水解4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性
一般情况下测定脂酶活性时采用4-methylumbelliferyloleate为底物，但该底物专一性不是很强，磷脂酶也能水解。测定这个性质可帮助判断本研究中纯化所得的磷脂水解酶是脂酶还是磷脂酶，因为虽然具有4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性不一定是脂酶，但若不具有该底物活性则一定不是脂酶。测定结果表明，磷脂水解酶1不能水解4-methylumbelliferyloleate荧光底物，磷脂水解酶2水解该荧光底物的比活为32 U/g蛋白质。这个结果意味着磷脂水解酶1肯定不是脂酶，而磷脂磷脂水解酶2既可能是脂酶也可能是磷脂酶。
3.5 气相色谱法测定磷脂水解酶的磷脂酶A1、A2活性
采用高纯度的单一卵磷脂（1-棕榈酸，2-花生四烯酸卵磷脂，Sigma）为底物，用气相色谱分析反应生成的游离脂肪酸的种类和数
量，从而判断A1、A2活性。磷脂水解酶1和2的测定结果见3，由表中可知，本研究中纯化所得的2种磷脂水解酶都同时具有磷脂酶A1和A2的活性，且A1活性要大于A2活性（A1活性分别约为A2活性的5倍和23倍）。磷脂水解酶1的A1活性略低于磷脂水解酶2，但A2活性约为磷脂水解酶2的3倍。
表3 气相色谱法测定磷脂水解酶的A1、A2活性
磷脂水解酶1
磷脂水解酶2
A1活性
（nmol棕榈酸/h）
585 752
A2活性
（nmol花生四烯酸/h）
105 33
3.6 磷脂水解酶同源性分析
采用肽质量指纹图谱技术（peptide mass fingerprint，PMF），分析目标酶和NCBInr数据库中其它来源的磷脂酶或脂酶的同源性。结果显示，磷脂水解酶1和天竺鼠中脂蛋白脂酶的匹配度约为22%；在数据库中没有找到和磷脂水解酶2相匹配的蛋白。这种情况出现的可能原因之一是在微量分析水平下目的蛋白质的片段覆盖率不够高，在MALDI条件下目的肽片段响应值太低。实验已证实在MALDI条件下C端为Lys的肽(Lys-肽)在质谱分析中的离子信号强度明显低于C端为Arg的肽(Arg-肽)，若胰蛋白酶消化片段中Lys-肽占主导，则会造成质谱信号的信噪比降低，从而减弱蛋白质的片段覆盖率；另外，蛋白质的共迁移使得在一个蛋白质点中可能存在两种或多种蛋白质，因而产生复杂的酶解片段， 使得其解析变得困难；除此之外，当所鉴定的蛋白质发生了翻译后修饰，而该信息并未包含在数据库中，或者是所分析的样品蛋白质本身就是一个新型的蛋白质， 所以在数据库中搜寻不到相匹配的目的蛋白质。资料检索显示，目前还没有研究者从哺乳动物骨骼肌中获得纯化的磷脂酶，NCBInr数据库中不存在骨骼肌磷脂酶的序列，而不同组织来源磷脂酶的同源性很低（杨建东等，2002），因此磷脂水解酶2很可能为一种新的磷脂酶；而磷脂水解酶1由于和天竺鼠中脂蛋白脂酶的匹配度约为22%但和猪中脂蛋白
没有同源性，无法做出判断。 3.7 温度对磷脂水解酶2活性的影响
35酶活（units)3025201510010203040温度（℃）50607080
图14磷脂水解酶2的最适反应温度
由最适反应温度图14可知，磷脂水解酶2的最适反应温度在40℃左右，与目前报道的猪骨骼肌磷脂酶的最适反应温度值42℃非常接近（郇延军等，2005），Audley（1978）从鱼肌肉中纯化的磷脂酶A的最适反应温度范围也为37-42℃。在干腌火腿的腌制阶段，温度较低（约4℃），但磷脂水解酶2的活性仍然高达最适反应温度时的56％，说明低温并不能很好的起到抑制磷脂水解酶2活性的作用，这或许是干腌火腿加工前期磷脂剧烈水解的原因之一。 3.8 pH对磷脂水解酶2活性的影响
300250酶活（units)200150100505678pH91011图15磷脂水解酶2的最适反应pH
在pH为5.5-10.5的范围内测定磷脂水解酶2的活性，由图15