可知，磷脂水解酶2在这个pH范围内均有活性，最适反应pH为8.5。在碱性范围pH 7.5-9.5酶活很高，分别为最大活性的86％和91％，而在pH为5.5时，仅为最大活性的30％左右。在对兔骨骼肌(Alasnier et al., 2000)、鱼骨骼肌(Audley et al., 1978)以及各种动物的心肌 (Wolf & Gross, 1985; Nalbone & Hostetler, 1985; Cao et al., 1978; Hazen, Ford & Gross, 1991) 的研究中都得到了类似的结果。一些研究者在心肌溶酶体中也发现了酸性磷脂酶（AGrynberg et al., 1988; Franson, Waite & Weglicki, 1972），但活性要比碱性磷脂酶A低得多。目前我们无法确定猪腿肌肉中是否存在酸性磷脂水解酶，因为酸性磷脂水解酶和碱性磷脂水解酶的活性pH范围存在重叠区，除非将溶酶体部分单独提取出来进行磷脂酶活性测定，以证实酸性磷脂酶的存在。
3.9 激活剂、抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响
为了帮助判断磷脂水解酶2的类别，本实验考察了一些典型的磷脂酶A或脂酶的激活剂或抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响。
NaF为脂酶的抑制剂。向反应体系中添加100 mmol/L NaF时，肌肉粗提液中磷脂水解酶的活性降低40％左右，且随着NaF浓度的增加，逐渐降低（图16）。这说明了两种可能性：第一，猪骨骼肌中脂酶参与了磷脂的水解；第二，高浓度NaF对猪骨骼肌中磷脂酶活性也具有一定的抑制作用。由图16可知，NaF对电泳纯的磷脂水解酶2也表现出了抑制作用，和肌肉粗提液不同的是100 mmol/L NaF对磷脂水解酶2的活性没有抑制作用。这个结果很难解释，如果因为NaF对磷脂水解酶2具有抑制作用，将其判断为脂酶，那我们将无法解释100 mmol/L NaF不对脂酶表现出抑制作用。所以很有可能上面提到的假设2正确，磷脂水解酶2是一种磷脂酶而不是脂酶。 120100 相对酶活(%)8060402000100200300400NaF浓度（mmol/l)纯磷脂水解酶2500600肌肉粗提液
图16 NaF对磷脂水解酶2活性的影响
250200相对酶活（％）15010050
00102030405060ATP浓度（mmol/l)肌肉粗提液纯磷脂水解酶2图17 ATP对磷脂水解酶2活性的影响
ATP是胞液磷脂酶A2（cPLA2）的激活剂。用ATP处理活化cPLA2
时，能促进丝氨酸残基的磷酸化，从而使cPLA2的活性增加约2倍。从图17可知，向反应液中加入10 mM ATP时，肌肉粗提液中磷脂水解酶活性增加为原来的176％，ATP浓度大于10 mM时，随着ATP浓度的增加，磷脂水解酶活性呈缓慢上升趋势。对于电泳纯的磷脂水解酶2来说，5 mM 的ATP对酶活没有作用，10 mM 的ATP能使酶活增加50％左右，但50 mM 的ATP对酶活有轻微的抑制作用。这种现象说明磷脂水解酶2的催化机制可能类似于cPLA2。
钙离子是磷脂酶A2分类的重要依据，Ⅰ-Ⅲ 型磷脂酶A2功能的发挥需要mM级的钙离子，Ⅳ型磷脂酶A2功能的发挥（转位于膜时）需要μM级的钙离子，另外一类为钙不依赖性。加入不同浓度的钙离子，肌肉粗提液中磷脂水解酶的活性不仅没有提高反而受到不同程度的抑制，说明猪骨骼肌中不存在Ⅰ-Ⅳ 型磷脂酶A2，或存在但不起主要作用。磷脂水解酶2的活性也没有因为钙离子的加入而表现出显著性提高，因此，磷脂水解酶2为钙不依赖性。
130110相对酶活(%)907050046CaCl2浓度（mmol/l)肌肉粗提液纯磷脂水解酶228200
相对酶活（％）
150100a b b 50001DTT浓度（mmol/l)5图18 DTT对磷脂水解酶2活性的影响
DTT为巯基激活剂。由图18，1 mmol/L DTT对磷脂水解酶2没有作用，但5 mmol/L DTT对磷脂水解酶2具有明显激活效果，使酶活性增加50％左右。资料显示，DTT对Ⅰ型和Ⅱ型磷脂酶A2具有明显的抑制作用，而cPLA2对DTT不敏感（杨在清等，1996），因此，再次证明了磷脂水解酶2不是Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型磷脂酶A2。 3.10 金属离子对磷脂水解酶2活性的影响
200
相对酶活（%)150100500EDTANa2Cu2+Mg2+Fe2+Fe3+ 1mM5mM 图19属离子对磷脂水解酶2活性的影响 Fe2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+和Zn2+ 以及Na2EDTA都对磷脂水解酶2的活性具有激活作用，使活性增加约50%，且1 mM和5 mM的浓度之间无显著性差异（图19本实验结果与范礼斌等人（1996）的研究结果差异较大，他们研究了金属离子对蛇毒磷脂酶A2的影响，认为K+ 增加磷脂酶A2的酶活性，而其它二价金属离子不同程度的抑制酶的活性，特别是Cu2+使酶的活性几乎完全丧失。这可能是不同来源的磷脂酶A同源性很低，性质差异较大的原因。 3.11 腌制剂对磷脂水解酶活性的影响
干腌火腿的腌制剂主要由食盐、硝酸盐和亚硝酸盐等组成，某些成分可能会对酶活产生一定的作用。本研究分析了不同浓度氯化钠、硝酸钠和亚硝酸钠对磷脂水解酶2活性的影响，添加量参考干腌火腿加工时的实际添加量并适当外延。
由图20可知，NaCl对磷脂水解酶2有显著的抑制作用（P<0.05），4%的盐浓度可将酶活性降至76%，随着盐浓度的增加抑制作用缓慢增强。Motilva & Toldra（1993）研究了NaCl对猪肌肉和脂肪组织中脂肪水解酶活性的影响，研究发现NaCl对各种脂酶的作用各不相同：对肌肉酸性脂酶有强烈的激活效果，当NaCl浓度为6-8％时，酸性脂酶的活性增加到原来的3倍左右；而对肌肉中性脂酶则表现出强烈的抑制作用，6%的NaCl甚至可以完全抑制肌肉中性脂酶的活性；肌
Zn2+对照肉中碱性脂酶的活性几乎不受盐含量的影响。脂肪组织中脂酶的情况和肌肉中正好相反，碱性脂酶受到NaCl的抑制而中性脂酶不受影响。本研究结果和郇延军等（2005）的结果存在较大差异，他们研究了NaCl对猪骨骼肌中磷脂酶的作用，发现NaCl能提高磷脂酶的活性，在NaCl含量为9.6%时，酶活达到最大值。分析其原因，可能是因为他们研究的是酸性磷脂酶，而酸性磷脂酶的性质可能和酸性脂酶相似。
10090相对活性（％）807060504030对照4681012NaCl含量(%)图20 Cl含量对磷脂水解酶活性的影响 140120 相对酶活（％）1008060402000306090120150亚硝酸钠含量（mg?kg-1）
图21 硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响 图22 亚硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响 本实验范围内的亚硝酸钠浓度对磷脂水解酶2的活性无显著性影响（图21），含量超过100 mg〃kg-1的硝酸钠对磷脂水解酶2的活
性有轻微的激活作用（图23）。在干腌火腿中亚硝酸钠的最大残留量不足10 mg〃kg-1，硝酸钠的最大残留量也低于50 mg〃kg-1（郇延军等，2005），如此低量的情况下，硝酸钠和亚硝酸钠对磷脂水解酶2的作用都可忽略不计。
15014013012011010090800100200300400500600硝酸钠浓度（mg?kg-1)相对酶活（％）
图21 亚硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响
3 结论
1) 磷脂水解酶1和2表观分子量分别为65.8 kDa和37.2 kDa。 2) 磷脂水解酶1肯定不属于脂酶类，是一种磷脂酶，因为其不具有4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性。磷脂水解酶2的4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性为32 U/g蛋白。磷脂水解酶1和2都同时具有磷脂酶A1活性和A2活性，且A1活性大于A2活性。
3) 磷脂水解酶1和2的底物浓度和反应初速度之间的关系复杂，1/V和1/S之间不成线性关系。
4) 磷脂水解酶2的最适温度为40℃，最适pH为8.5。
5) 通过特异性激活剂和抑制剂判断，磷脂水解酶2不是Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型磷脂酶A2。
6) 氯化钠对磷脂酶2活性具有抑制作用，亚硝酸钠对其活性没有影响，100 ppm以上的硝酸钠对磷脂水解酶2的活性有轻微的激活作用，但干腌火腿中的残留量不足以激活磷脂水解酶2的活性。