实验一 微生物的分离和纯化
本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容，在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候，不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后，能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求
1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法。 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件。 二、原理
培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围。根据研究目的不同，可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8%的琼脂。有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。
由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。
灭菌的方法很多，最常用的是加压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在每平方厘米为一个大气压（即15磅/时2）的压力下，温度可达121℃，一般只要持续15～20分钟后，就可杀死一切
微生物的营养体和它们的各种孢子。
由于加压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物的，所以，该法只有当灭菌锅内的空气完全排尽后，才能达到最佳效果。
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。
为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免菌源中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10％的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌（如加链霉素25～50 u/ml以抑制细菌；添加制霉菌素50 u/ml或多菌灵30 u/ml以抑制霉菌）。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为pH 7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。 三、试验材料
1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、麦芽汁、氢氧化钠
2．其它：试管、三角瓶、移液管、烧杯、量筒、玻棒、漏斗、纱布、棉花、牛皮纸、天平、PH试纸、马铃薯干、高压蒸汽灭菌锅。
3无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒（刮刀）、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
四、试验方法与步骤：
（一） 玻璃器皿的准备 培养基的配制消毒灭菌
1．根据实验需要，准备各种玻璃器皿，洗刷干净，用报纸包扎好，进行干热灭菌。需要什么，需要多少，各实验组要认真核算，否则影响实验进程。 2．培养基的配制：
（1）称药品： 根据配方，计算出试验中各种药品所需要的量，然后分别称取。 （2）溶解： 一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内，先加入少于所需要的总体积的水进行加热溶解（但在配置化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想）。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，，补足水分到需要的总体积。 （3）调节PH： 用滴管逐滴加入1N的NaOH，边搅动，边用精密的PH试纸测其PH值，直到符合要求时为止。PH值也可用PH计来测。 （4）过滤： 要趁热用四层纱布过滤。
（5）分装： 按照实验要求进行分装。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口，以免弄湿棉塞，造成污染。 培养基的分装装置见图
（6）加塞： 培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证优良还得通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形与未开伞的蘑菇相似，其大小、松紧都应适当。
加塞时，棉塞总长度的3/5应在口内，2/5应在口外。
作棉塞的棉花要选用纤维较长的，一般不用脱脂棉作棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也较贵。 棉塞的一般制作方法可参见图
如果培养基在短期内使用，不用棉塞，直接套上一只铝质试管帽也可试管帽是通过互相交叉的弹簧丝来控制与试管的松紧度。它的外形、构造如图
在微生物实验或科研工作中，常常要用到通气塞。所谓的通气塞就是用几层纱布（一般是六至八层）做成的、通气性能更加良好的塞子。通气塞加在装有液体培
养基的三角烧瓶瓶口上，放在摇床上进行振荡培养，可获得更多的氧气来促进菌体生长或进行发酵。它的形状如图
（7）包扎：棉塞塞好以后，试管用棉绳扎成捆。在棉塞的外面包上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水的沾湿和灭菌后的灰尘侵入。然后再用棉绳扎好，挂上标签，注明培养基的名称及配制日期。
（8）灭菌：一般情况下，培养基配好以后，应立即灭菌。如不及时灭菌，应放入冰箱内保存。
（9）搁置斜面：灭菌后，固体培养基如需制成斜面，应在未凝固前将试馆有塞的一头搁在一根长的玻棒或木条上即可。搁置的斜度要适当。斜面长度一般以不超过时管长度的1/2为宜 3．培养基的灭菌：
（1）加水： 直接往灭菌锅内加水约3升
（2）装料： 将待灭菌的物品放在灭菌桶内。包于包之间留有适当的空隙，以利蒸汽的流通。
（3）密封： 将盖上的软管插入灭菌桶的槽内。上下对齐，拧紧螺栓，切勿滴漏气。
（4）升压： 点燃煤气，加热至水沸腾，排尽锅内空气（可将排出的气体用橡皮管引至深层冷水中，如只听有“噗噗”之声而未见气泡逸出水面，表示锅内空气以排尽）。然后盖上放气阀，升压。
（5）灭菌： 待压力达到一定时，关小煤气，使其恒压，并开始计算灭菌时间。 （6）降压： 达到规定的灭菌时间后，关闭煤气，让其自然降压冷却。 （7）取料： 待压力完全降至“零”后，打开放气阀，再松动螺栓，拿掉盖子，从灭菌筒内取出灭过菌的材料。
（8）倒水： 灭菌锅用好以后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。 按照上面的步骤，参照教材，配置下列培养基，配制的量，同学们自己估算，要略有剩余，不能浪费。 A.配制营养琼脂培养基。 B.配制高氏一号培养基。 C.配制马丁氏培养基。
D.分装上述培养基与三角瓶和试管中，并包扎
E.将上述配置分装和包扎好的培养基进行高压蒸汽灭菌 （二） 土壤中细菌、放线菌、真菌的分离与纯化 1．细菌的分离
（1）制备土壤稀释液 称取土样1g，在火焰旁加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中，振荡10～20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10-2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10-7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10-3??10-7顺序编号，放置试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夹在手上，不能乱放在桌上），将1ml移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后准确吸取0.5ml 10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽（或棉塞），将0.5ml 10-2土壤稀释液注入4.5ml无菌水试管内，制成10-3的土壤稀释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽，右手持10-3稀释液试管在左手上敲打20～30次，混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出0.5ml 10的稀释液，置第二支装有4.5ml无菌水试管中，制成10土壤稀释液。用同法再制成10-5、10-6、10-7的土壤稀释液（为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管）。最后用毕的移液管重新放入纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中，用3％～5％来苏尔浸泡1h后再灭菌洗涤。
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