与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。 （二）乙酰甲基甲醇试验(V．P试验) 1.目的
了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法． 2.原理
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 3.材料 (1)菌种
大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、 (2)培养基
葡萄糖蛋白胨培养液的试管 4.流程
培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5.步骤 (1)标记试管
取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 (2) 接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。 (3) 观察记录
取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min
后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。 注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。 （三）甲基红试验（M.R.试验） 1.目的
了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法． 2.原理
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 3.材料 (1) 菌种 同V．P试验 (2) 培养基 同V．P试验 4.流程
培养液→指示剂→观察→记录结果 5.步骤
于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
（四）吲哚试验 1.目的
掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法 2.原理
有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。
3.材料 (1) 菌种 测试菌株． (2) 培养基 蛋白胨水培养基 (3) 试剂
二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 4. 流程
标记试管→接种→培养→观察→记录 5. 步骤 (1) 试管标记
取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 (2) 接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。 (3) 观察记录
在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。 6. 结果
记录生理生化反应测定结果． 7. 思考
1) 以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么？ 2) 细菌生理生化反应试验中为什么要设对照． 3) 试设计一试验方案，鉴别一株肠道细菌．
实验五 化学因素对微生物的影响
一、目的要求
1．了解常用化学药品对微生物的作用。 2．学习测定石炭酸系数的方法。 二、基本原理
常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类，酚、醇、醛等有机化合物以及碘、表面活性剂等。它们的杀菌或抑菌作用主要是使菌体蛋白质变性，或者与酶的—SH基结合而使酶失去活性所致。
本实验是观察某些常用的化学药品在一定浓度下对微生物的致死或抑菌作用，从而了解它们的杀菌或抑菌性能。
为了比较各种化学消毒剂的杀菌能力，常以石炭酸为标准，即将某一消毒剂作不同稀释后，在一定条件下，一定时间内致死全部供试微生物的最高稀释浓度，与达到同样效果的石炭酸的最高稀释度的比值，称为这种消毒剂对该种微生物的石炭酸系数（酚系数）。石炭酸系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。 三、器材
大肠杆菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2．5％碘酒，0．1％升汞（HgCl2），5％石炭酸，75％酒精，1％来苏尔，0．25％新洁尔灭， 0．005％龙胆紫，0．05％龙胆紫； 培养皿，滤纸片，试管，吸管等。 四、操作步骤
1．各种化学药品的杀菌作用
(1)用无菌吸管吸取培养18小时的白色葡萄球菌菌液0．2ml于无菌平皿内。 (2)倒入已溶化并冷至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于上述平皿内，充分摇匀，水平放置，待凝。
(3)将上述已凝固的平皿用记号笔在平皿底划成八等份，每一等份内标明一种药物的名称。
(4)用无菌镊子将小圆形滤纸片分别浸入各种药品中，取出，并在试管内壁上除去多余药液后，以无菌操作将纸片对号放入培养皿的小区内，如图Ⅸ-1。
(5)将上述放好滤纸片的含菌平皿，倒置于37℃温室中培养24小时后，取出测定抑菌圈大小，并说明其杀菌强弱。 2．石炭酸系数的测定
（1）将5％（1：20）的石炭酸液按表Ⅸ-1配成不同浓度，每管5ml。 （2）将待测药物（来苏尔）先配成1：20的原液，再按表Ⅸ-2配成不同浓度，每管 5ml。
（3）取肉膏蛋白胨液体培养基30管，1—15管标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理，16—30管标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理。
（4）在上述不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液中，各接入0．5ml大肠杆菌液，摇匀。注意每管自接种时起在5、10、15分钟，用同一接种环从各管内取一环接入上述已标记的液体培养基试管中。
（5）置37℃温室中培养 48小时，观察并记录生长情况。生长者溶液混浊，以“+”表示；不生长者溶液澄清，以“-”表示。
（6）计算系数值 找出在5分钟生长，而在10分钟和15分钟均不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释度，计算二者的比值。例如石炭酸在10分钟内杀死大肠杆菌的最大稀释度是1：70，来苏尔是1：250，则来苏尔的石炭酸系数为250/70=3．6。 五、实验报告 1、结果
（1）各种化学药品对白色葡萄球菌的致死能力 （2）石炭酸系数的测定和计算
（3）来苏尔对大肠杆菌的石炭酸系数是多少？ 2．思考题：
化学药剂对微生物所形成的抑菌圈未长菌部分是否说明微生物细胞已被杀死？