（2）倾注法分离 取无菌培养皿6～9个，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按无菌操作技术加到相应编号10-7的无菌培养皿内。再以相同方法分别吸取1ml 10-6、10-5的土壤稀释液，各加到相应编号为10-5、10-6的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45～50℃左右，分别倾入到已盛有10-5、10-6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多，也会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拔开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12～15ml，将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置桌上。整个操作过程见图
（3）培养 待平板完全冷凝后，将平板倒置于37℃恒温箱中，培养24～48h观察结果。
2．放线菌的分离
（1）制备土壤稀释 液称取土样1g，加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中，并加入10滴10％的酚溶液（抑制细菌生长），有时也可不加酚。振荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。
（2）倾注法分离 按前法将土壤稀释液分别稀释为10-3、10-4、10-5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1ml 10-5、10-4、10-3土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行皿。
（3）培养 冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养5～7d观察结果。 3．真菌的分离
（1）制备土壤稀释液 称取土样5g，加入到一个盛有95ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液。
（2）倾注法分离 依前法将土壤稀释液再稀释成10-3、10-4的土壤稀释液。然后用无菌移液管分别吸取1ml 10-4、10-3、10-2土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内。采用马丁培养基倾倒平板，为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马丁培养基临用前需无菌加入孟加拉红、链霉素和去氧胆酸钠。每个稀释度作2～3平行皿。
（3）培养 冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养3～5d后观察结果。 （三）划线分离法
菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种针上的菌（图6-1-4A）；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60～70°划线（见图6-1-4B），每换一次角度，应将接种针上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。 1．连续划线法
以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落（参见附录四微生物的接种技术）。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠（图6-1-4A，6-1-5）。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷凉后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落）。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
2．分区划线法（四分区划线法，图6-1-4B）
取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。
本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。
五、复习思考题：
1．分析新配制培养基中，何为碳源，何为氮源？ 2．如何检查灭过菌的培养基是否无菌？
3．培养基为什么要调整pH值？细菌、放线菌、酵母菌、霉菌生长最适pH值为
多少？
4．根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、酵母菌与霉菌？它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系？
实验二 微生物的染色
由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。
一、染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养