目镜测微尺及其安装方法如图 三、操作步骤
1、目镜测微尺的校正 把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把血球计数板置于载物台上，使刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清血球计数板的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与血球计数板的刻度平行，移动推动器、使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和血球计数板的格数。因为血球计数板的刻度每格长50微米，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度：
目镜测微尺每格长度?两重合线间血球计数板格数?50?m两重合线间目镜测微尺格数
例如目镜测微尺10小格等于血球计数板2小格，已知血球计数板每小格为50微米则2小格的长度为2×50微米＝100微米，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为：
2?50微米?10微米10
同法校正在高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
2、测定巨大芽孢杆菌细胞大小 换上巨大芽孢杆菌标本片，先在低倍镜下找到目的物，然后在油镜下转动目镜测微尺，测出巨大芽孢杆菌菌体的长、宽各占几格(不足一格的部分估计到小数点后一位数)，测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。
一般测量菌的大小要在同一个涂片上测定10-20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 四、注意事项
1、 当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
2、 不能用血球计数板对目镜测微尺在油镜下进行校正时，此时目镜测微尺每格相当于1微米。
Ⅱ、微生物的显微镜直接计数法
一、实验原理
测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图Ⅳ-2)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图5)。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。
图Ⅳ-2 血球计数扳的构造
a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)
b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)
图Ⅳ-3 血球计数板计数网的分区和分格
二、实验器材
1、1、 菌种 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌液； 2、2、 仪器 显微镜，血球计数板； 3、3、 材料 盖玻片，吸水纸，尖嘴滴管。 三、操作步骤
1、视待测菌液浓度，加无菌水适当稀释(斜面一般稀释到10-2)，以每小格的菌数可数为度。
2、取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。
3、将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。
4、静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 5、计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6、凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。
每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数 7、血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。 四、注意事项
1 加酵母菌液时，量不应过多，不能产生气泡。
1、由于酵母菌菌体无色透明，计数观察时应仔细调节光线。或者用吕氏碱
性美蓝染液处理酵母菌液。
实验四 细菌的生理生化试验
一、目的
（一）了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 （二）掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 二、原理
各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 三、材料 （一）菌种
大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、 （二）培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） （三）试剂
40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 （四）器具
超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 四、流程
糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验 五、步骤 (一)糖类发酵试验 1.目的
了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2.原理
可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 3.材料 （1） 菌种
大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、 （2） 培养基
葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 4.流程
发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5.步骤
(1)试管标记图糖发酵产气
取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气 4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
(2)接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。 (3)观察记录