分子生物学
第一章 遗传的物质基础 重点内容：
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验证核酸是遗传物质的实验名称
DNA的一级结构、二级结构、三级结构 DNA的性质：变性、复性 tRNA的二级、三级结构 rRNA的种类 ? mRNA的结构
第一节 遗传物质的本质---核酸 遗传物质必须具备哪些特点？
在体细胞中含量稳定；在生殖细胞中含量减半；能携带遗传信息；能精确的自我复制；能发生变异。 肺炎链球菌转化实验、T2噬菌体转导实验（DNA为T2噬菌体的遗传物质）、真核细胞转染实验（真核细胞的遗传物质也是DNA）
结论：DNA是多数细胞生命体的遗传物质；DNA也是许多病毒的遗传物质，一些病毒使用RNA作为遗传物质 第二节 核酸的化学组成、结构特征与性质 一、核酸的化学组成
核酸 核苷酸 核苷 核糖 脱氧核糖 碱基 1、基本化学成分
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基本单位——核苷酸（nucleotide）；
每分子核苷酸包含一个碳、氮原子的杂环化合物（碱基），一个环状五碳糖（戊糖），和一个磷酸分
子基团；
? 碱基(Base)有两种类型: 嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）； ? 戊糖也有两种：2-脱氧核糖和核糖。
? DNA中戊糖是2-脱氧核糖，而在RNA中是核糖； ? 不同在于糖环2位上是否存在羟基基团
核苷酸的连接：5’-三磷酸核苷酸是核酸合成的前体。
三磷酸的5’末端同多聚核苷酸链末端的3’-OH多聚核苷酸链末端的糖的3’-OH成键。
寡核苷酸（oligonucleotide)
一般是指二至十几个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。 二、DNA结构与性质
1、基本概念
Antiparallel strands of the double helix are organized in opposite orientation, so that the 5′ end of one strand is aligned with the 3′ end of the other strand.
Base pairing describes the specific (complementary) interactions of Adenine with Thymine or of Cytosine with Guanine in a DNA double helix (Thymine is replaced by Uracil in double helical RNA).
Complementary base pairs are defined by the pairing reactions in double helical nucleic acids (A with T in DNA or with U in RNA, and C with G).
Supercoiling describes the coiling of a closed duplex DNA in space so that it crosses over its own axis.
DNA一级结构：指DNA分子中核苷酸的排列顺序，由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺序。 基因：遗传信息都包含在组成DNA的A,G,C,T这四种核苷酸的排列顺序之中。DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，这就是基因。
基因的功能取决于DNA的一级结构 DNA二级结构
DNA双螺旋结构的要点
? 主链（backbone）：脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接而成。二条主链绕一共同轴心以右手方向盘旋、反向
平行形成双螺旋构型。主链处于螺旋外则。
? 碱基对（base pair）：碱基位于螺旋的内则，以垂直于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链糖基相连。同一平面的碱
基在二条主链间形成碱基对。配对碱基总是A与T和G与C。碱基对以氢键维系，A与T 间形成两个氢键， G与C 间形成两个氢键。
? 大沟和小沟：大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间,而大
沟位于相毗邻的双股之间。这是由于连接于两条主链糖基上的配对碱基并非直接相对, 从而使得在主链间沿螺旋形成空隙不等的大沟和小沟。 在大沟和小沟内的碱基对中的N 和O 原子朝向分子表面。
? 结构参数：螺旋直径2nm；螺旋周期包含10对碱基；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。 DNA结构的多态性：
DNA构象的改变的因素：核苷酸顺序、碱基组成、盐的种类、相对湿度。 B-DNA, A-DNA, C-DNA, D-DNA, S-DNA
共同特征：右手双螺旋；两条反向平行的核苷酸链通过Ｗatson-Crick碱基配对结合在一起；链的重复单位是单核苷酸；这些螺旋中都有两个螺旋沟，分为大沟与小沟，只是它们的宽窄和深浅程度有所不同。 Z-DNA：
? 嘌呤与嘧啶交替排列(GGCGCG); ? 左手双螺旋;
? 只有一个螺旋沟，狭而深;
? 细胞DNA分子中确实存在Z-DNA区; ? 胞嘧啶第五位碳原子的甲基化，
? 可使B-DNA不稳定而转变为Z-DNA。 Z-DNA的生物学意义
(1) 可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿
类动物病毒的复制起始部位有d(GC)有交替顺序的存在； (2)在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。
(3)原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活性，小核和繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录有关。 DNA三级结构
DNA的三级结构，是指在一、二级结构基础上的多聚核苷酸链的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲。 三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体 检测DNA三级结构的方法： 密度梯度离心、 凝胶电泳、 电镜观察
染色体的结构：核小体——染色体的初级结构。 第一级的包装是将DNA变成串珠状物质，串珠状颗粒称核小体. 螺线体 10nm“珠串”的进一步压缩，由每圈5-6个核小体盘旋而成直径约30nm的纤丝。这一级包装又将染色体压缩了6倍，
染色体环 螺线体还可进一步形成更大的环。进一步压缩成染色质和染色体结构，需非组蛋白参与。间期染色质和中期染色体均有大环的组织结构，每一个环可以是独立的超螺旋区，环上的碱基由DNA上的特异位点连接到中期骨架或核质上。 DNA的主要性质： 1）DNA的碱基组成
? GC含量：DNA的碱基组成通常用GC百分含量表示，注意所谓百分含量是指摩尔百分比。 2）DNA分子的形状与大小
? 形状：DNA分子以线形或环状形式存在，大多数是双链的，少数是单链的。高等动物、植物的DNA一般是双
链线状，原核生物DNA多数为双链环状，少数病毒DNA可能是单链环状或单链线状。 ? 大小：差异悬殊，大小可相差几十亿倍。 3）变性（Denaturation）或解链（melting）
? 稳定的双螺旋结构DNA分子由于维持稳定性的氢键和疏水键的断裂，松解为无规则线性结构的现象； ? 条件：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、尿素及甲酰
胺等。
断裂可以是部分的或全部的，是可逆的或 是非可逆的；
DNA变性不涉及到其一级结构的改变； 变性过程的表现
¤ 导致一些理化性质发生变化
¤ 是爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围
变性导致的理化及生物学性质的改变
? 粘度降低 变性后紧密的DNA双螺旋变成松散的无规则单股线性结构，粘度明显下降。 ? 旋光性改变 变性后DNA分子的对称性及分子局部构性改变, 使DNA溶液旋光性发生变化。
? 增色效应或高色效应(hyperchromic effect) 核酸在紫外光260nm具有强烈的吸收峰。结构越有序，吸收的光
越少。即游离的核苷酸比单链的RNA或DNA吸收更多的光，而单链RNA或DNA的吸收又比双链DNA分子强。当DNA变性时，其光吸收值增加，这种现象即为增色效应；反之为减色效应。 DNA定性定量-吸收光谱值
? 双链DNA的A260=1.00（浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）； ? 单链DNA的A260=1.37； ? 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。 DNA变性曲线
变性温度或融解温度(Tm)：变性过程中在非常狭窄的温度范围内，紫外增色效应会出现一个飞跃。紫外吸收值发生跳跃的温度称为DNA的融点。Tm值实际上是目标DNA的一半变性时的温度，它受DNA碱基组成和变性条件的影响。
影响Tm值的因素
? DNA溶剂（正离子的浓度）； ? DNA本身性质：
DNA的均一性： 1）DNA分子中碱基组成的均一性；2）待测样品DNA的组成是否均一； DNA的(G+C)含量 Tm与(G+C)含量的关系
经验公式： Tm = 69.3+0.41(G +C)% 或X%(G+C)=2.44(Tm-69.3)（DNA溶于0.2mol/L NaCl中） 4）复性（Renaturation) 指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA经缓慢冷却后即可复性,此过程称为“ 退火”(annealing)。 双螺旋呼吸
双链DNA配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，特别是在稳定性较低的富含A-T的区段，常常出现瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作用。一些蛋白质可识别这种结构，并在单链结构下阅读和识别DNA内部所含信息。
影响DNA复性的因素
? 温度：从热运动角度考虑，Tm以下较高温度有利于复性，比Tm低25℃左右的温度是复性最佳条件。低温（<4℃）
下分子热运动减弱互补链结合机会大大减少。
? 时间：降温时间太短以及温差大均不利于复性。温度下降须缓慢，若迅速冷却至低温，复性几乎是及不可能的。 ? DNA浓度：溶液中DNA分子越多，相互结合机会越大。复性第一步是两个单链分子间相互作用，其速度与DNA
浓度平方成正比。
? DNA顺序的复杂性：简单顺序的DNA分子互补碱基的配对较易实现，而顺序复杂的DNA序列要实现互补则困
难得多。
? 盐的浓度：高or 低 复性动力学公式
? 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ） ? 遵循二级反应动力学
dCt / dt = -KC02 反应初始 t = 0 单链 DNA浓度 = C0 反应达 t 时 单链DNA浓度 = Ct K＝复性速
度常数
Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L)常数 C0t(1/2)值对DNA具有特征性，其中与DNA的碱基对数目成反相关。
根据复性动力学公式我们可以知道些什么？ (1) 单链浓度随着时间的增大而减小； (2 ) 反应速率取决于初始的单链浓度Co；
(3) C0t1/2：标准条件下（一般为0.18ml/L阳离子浓度）测得的复性率达1/2时的C0t值。该值与核苷酸对的复杂性成正比；
(4) 以反应浓度和C0t1/2为座标可绘复性曲线； (5) 通过C0t1/2值可测原核生物基因组的大小。
5）核酸分子杂交：分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。
杂交的本质就是在一定条件下（加热或碱处理）使双螺旋解开成为单链,使互补核酸链实现复性。因此,变性技术也是核酸杂交的一个环节。
杂交技术的种类 原位杂交（in situ hybridization）、斑点杂交（dot blotting）、Southern blotting--DNA、northern blotting--RNA、Western blotting—Protein 6）DNA的检测和测定 ? 分子量检测：电泳 ? 质量或浓度检测： EB染色
分光光度技术: 260nm光吸收 化学检测:二苯胺,地衣酚 放射性检测
Transcription is synthesis of RNA on a DNA template. Several different types of RNA are generated by transcription. The three principal classes involved in the synthesis of proteins are: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA) 。
Coding strand or Sense strand
The strand bears the same sequence as the mRNA (except for possessing T instead of U) Template strand or Antisense strand
The strand of DNA that directs synthesis of the mRNA via complementary base pairing (The non-template strand is identical in sequence to the RNA product.)
RNA的结构与功能
1、转移RNA(transfer RNA，tRNA)
? Aminoacyl-tRNA is transfer RNA carrying an amino acid; the covalent linkage is between the NH2 group of the
amino acid and either the 3’- or 2’-OH group of the terminal base of the tRNA. ? Anticodon is a trinucleotide sequence in tRNA which is complementary to the codon in mRNA and enables the
tRNA to place the appropriate amino acid in response to the codon.
? Loop is a single-stranded region at the end of a hairpin in RNA (or single-stranded DNA). ? Stem is the base-paired segment of a hairpin.
1）tRNA的结构特征
? tRNA通常由70-90个核苷酸组成 ，每种氨基酸至少有一个tRNA分子； ? tRNA有很多的稀有碱基，主要是甲基化碱基、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶等；
? tRNA的二级结构为三叶草形（cloverleaf），其中互补配对碱基形成茎结构，不配对的则形成环状，茎环结构被
称为tRNA的臂；
? tRNA具有倒L型的三级结构，这种结构靠氢键维持。 tRNA 的二级结构------三叶草型 tRNA 三级结构----L形 L型结构
(1) tRNA 三级结构呈L形，这种结构是靠氢键来维持；
(2) D环和TψC环形成了“L” 的转角，氨基酸受体臂位于L型的一侧，距反密码子环约70A。 (3)在一些保守和半保守的碱基之间形成很多的三级氢键，使分子形成L形，并使结构稳定。 (4)几乎所有的碱基平面之间产生堆积作用。 (5)在反密码子茎中仅有很少的三级氢键。 2）tRNA的功能
tRNA作为连接子（adaptor）介导了mRNA中的三联体密码子与氨基酸之间的相互关联。
tRNA具备作为“接头”的双重特性，既能识别氨基酸也能识别密码子。3’末端的腺苷酸可与一氨基酸共价连接，反密码子则与mRNA中的密码子碱基配对。 tRNA的其它功能
在逆转录中作为合成互补DNA链的引物；
参与细菌细胞壁、叶绿素、脂多糖和氨酰磷脂酰甘油的合成。 3）tRNA的种类
起始tRNA和延伸tRNA：能特异地识别mRNA模板链上起始密码子的tRNA叫起始tRNA；其他tRNA称为延伸tRNA。 原核生物中，起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet） 真核生物中，起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）
同工tRNA：一种氨基酸可能有多个密码子，为了识别也就有多个tRNA，即多个tRNA代表一 种氨基酸，这些tRNA称为同工tRNA。
校正tRNA：由校正基因突变产生，通过改变反密码子区校正无义突变和错义突变。
无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。无义突变可被一个反密码子突变了的tRNA所抑制。此tRNA在突变密码子上插入一个氨基酸，产生全长的蛋白质，原有的密码子的氨酸残基被新的氨酸取代。 错义突变
错义抑制子和野生型相竞争。
错义抑制发生在tRNA反密码子突变后，它识别错误的密码子。因此野生型tRNA和抑制子tRNA都可以识别错义密码子，所以抑制仅仅是部分的抑制。 抑制突变的特点
1.不是所有抑制基因都能产生有功能的蛋白质，关键是要看氨基酸取代的情况。