三、质体基因组 1、叶绿体DNA的性质 ? ? ?
cp DNA是双链环状超螺旋结构分子，伞藻的cp DNA是双链线状的； cp DNA的GC含量与核DNA及mt DNA常存在明显不同；
cp DNA分子长度是动物mt DNA的9-10倍，大DNA分子编码更多的基因。
2、叶绿体基因组
（1）基因组由两个IR和一个 SSC及一个 LSC （2）IRA和IRB，编码相同，方向相反。
（3）cpDNA启动子和原核生物的相似，基因产生单顺反子或多顺反子的mRNA；
（4）不同cpDNA基因组成和数目几乎是相同的，产物多为类囊体的成分或和氧化还原反应有关； （5）其tRNA基因中有内含子，有的位于D环上， 此和原核及真核生物核tRNA都不相同； （6）所有叶绿体基因转录的mRNA都由叶绿体核糖体翻译。 （7） cp基因组相对较大，高等植物~140 kb，低等植物~200 kb； （8）cp基因组为多拷贝。但衣藻只有一个cp； 第四节 分子标记技术简介 广义
分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶及等位酶。 狭义
只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。用来作为指纹鉴定或区分个体特点的DNA片段。这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面越来越成为有用的工具。 特点：
(1)具有高的多态性； (2)共显性遗传；
(3)能明确辨别等位基因；
(4)遍布整个基因组，分子标记均匀分布； (5)检测手段简单、快速；
(6) 开发成本和使用成本尽量低廉；
(7)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）
第三章 遗传物质的复制
第一节 核酸复制的特征 一、核酸生物合成的一般规则
1、按照碱基配对原则，以现有的DNA链为模板合成新拷贝；部分DNA是以RNA为模板反转录的结果； 2、核酸的生物合成只能从5
3’方向进行；
3、特异的聚合酶类催化核酸的生物合成； 4、聚合酶的底物核苷酸是5’-NTP或5’-dNTP；
5、DNA聚合酶不能催化从头开始合成DNA，必需具有引物。
DNA复制是分别以亲代螺旋双链中的一条为模板合成其互补链，由此产生的两条子代双螺旋都是由一条亲代链和一条新合成链组成，因此称做半保留复制。 三、复制子、复制起始点与终止点 1、复制子（replicon）:
1）复制子是基因组中 DNA分子的复制单位；
2）复制子含有控制复制起始的特定位点，即复制起始点，以及控制复制终止的终止点。因此复制子是从复制起点到终止点的区域；
3）细菌染色体、质粒、病毒只有一个复制起点，整个DNA分子构成一个复制子；真核生物染色体有多个起始点，含多个复制子。 2、复制起点(origin) 1）原核生物的复制起点
特征：
通常富含A/T碱基对，常见回文序列和重复序列的结构；
复制起点中的顺式DNA序列（反向重复顺序）通过与特异的反式作用蛋白质因子反应激活复制；
原核生物复制起点常有较固定的碱基顺序和结构，不同物种间保守性较高，某些位点的单碱基缺失即可使复制子失活。 功能：
可以起始一个复制循环，并控制起始反应的频率； 把完成复制的染色体分配到子细胞中去。 2）真核生物的复制起点
酵母DNA的复制起点——自主复制序列（ARS） 酵母染色体为多复制子，但不同的起点使用频率有差别；
复制起点ARS1：185bps，由A、B1、B2和B3四个元件组成，这4个元件为都是ARS1功能所必需； A元件为核心元件，该改变任何一个碱基将导致ARS1失活。 四、复制叉与复制方向 1、复制叉（replication fork）
DNA复制过程中亲本双螺旋DNA两条单链解离的位点，由于双链解离从而呈现叉状； 2、 复制方向
DNA复制大多为双向等速进行，此外还有不对称的双向复制（枯草杆菌）和单向复制（ mt DNA D-环式复制）。 3、复制速度
原核生物DNA复制速度较快，如E.coli DNA复制速度大约是105 bp/min;
真核细胞的DNA聚合酶活性低，复制速度约为500-5000bp/ min；从多复制原点同时开始并双向复制。 五、复制方式的多样性 1、根据形态可分为： 1）线形DNA双链的复制
线性DNA双链的复制叉生长方式有单一起点的单向（如腺病毒）及双向（如T7噬菌体）和多个起始点的双向，复制叉处呈现“眼”型；
2）环状DNA双链的复制
型 环状双链DNA分子复制时形成两个方向相反的复制叉 滚环型 一种单向复制方式
D-环型 一种单向复制的特殊形式，两条链的复制起点不重合，各有一复制起点。
滚环复制：在一条链上产生一个缺口，DNA多聚酶延伸这一缺口的3’-OH端，新合成链替换原先的亲链，因为增
2、根据DNA合成的起始方式
重新起始(de novo initiation)，子链的复制是重新开始，如复制叉式复制； 共价延伸，子链是共价结合在一条亲本链上，如滚环式复制。 六、半不连续复制 Semidiscontinuous Replication
半不连续复制 DNA以两条亲本链为模板合成子链时，一条子链的合成是连续的，另一条是不连续的。 前导链与后滞链（leading and lagging strand） DNA双链复制时，一条子链沿自身5‘→3’方向持续合成，即前导链；而另一条子链的合成是不连续的，即后滞链。
冈崎片段(Okazaki fragment) 后滞链合成时，先以亲本链为模板按5’→3’方向合成出许多1kb-2kb的不连续片段，
被称做冈崎片段；然后这些短片段共价联结成一条完整的后滞链，后滞链的成长方向与其片段的合成方向相反。
第二节 参与复制的酶和蛋白质因子
复制体（replisome）
担负DNA合成的多聚蛋白结构，在复制叉处装配。包括了DNA聚合酶和其它酶类。 构成复制体的几种主要酶类及蛋白质因子
DNA解旋酶（DNA helicase） DNA拓扑异构酶（topoisomerase）
单链结合蛋白（single strand binding protein, SSB） DNA聚合酶（DNA polymerase） DNA连接酶（DNA ligase） DNA引发酶（DNA primase） RNaseH
一、超螺旋构象变化及解链有关的酶和蛋白
（一）DNA解旋酶（helicase) ? ? ? ? ?
DNA双链解旋：该酶沿单链DNA移动，利用ATP水解获得能量打断氢键。
解旋酶是DNA复制过程中进入复制体的第一个组分，是复制过程中提供单链模板所必需的。 DNA双链解开需要有改变DNA拓扑结构的酶；
解链产生扭曲张力，去除和解离复制和重组中产生的节和环。
两种功能类型：I 型拓扑异构酶只剪切一条链，作用于含缺口的底物；II 型拓扑异构酶同时切开两条链，可作用于共价闭环链。
1、DNA拓扑异构酶I （Topoisomerase I） 1）特点
1．对超螺旋DNA双链底物，仅切开一条链；
2．配对链通过切口及断端再连接而改变DNA拓扑态，一步反应可改变链环数1; 3．不需要能量，不能除去正超螺旋等需能量的反应，对正超螺旋不敏感； 4．主要在DNA损伤修复中起作用。 2、DNA拓扑异构酶II（Topoisomerase II） 1）特点
1．同时切割超螺旋DNA的双链，并重新连接，一次反应能改变两个连环数； 2．需要辅助因子ATP能量，能除去正超螺旋等需能量的反应； 3．主要在DNA复制中起作用。 2）Topo II 可分为两个亚类
一亚类能引入负超螺旋，如E. coli旋转酶（gyrase）
另一亚类是使超螺旋DNA（无论正负）变为没有超螺旋的松弛DNA。 （三）单链结合蛋白 （SSB）
1、SSB是缺乏酶活性的复制辅助蛋白，是复制体其它酶有效活性所必需的。SSB对单链DNA有高亲和性，对双链没有亲和力。 2、功能
稳定DNA单链区域：稳定熔解起点、维持螺旋酶活性、从DNA模板上去除二级结构、抑制核酸酶活性； 与复制体不同组分相互作用以促进这些组分的活性，例如与引发酶或引发体的组分相互作用促进其特定的引发活性。
（二）DNA拓扑异构酶
二、复制延伸和终止有关的酶和蛋白
（一）DNA聚合酶
1、DNA聚合酶
以DNA为模板合成DNA新链时需要的酶，DNA聚合酶从5‘到3’把核苷酸连续加在延伸DNA的游离3‘羟基上。 2、DNA聚合酶的特性 1）底物必须是dNTP；
2）以DNA为模板，链延伸功能，不能从头开始合成； 3）合成方向只能是5‘→3’。
3、DNA聚合酶的种类——大肠杆菌
大肠杆菌有多种DNA聚合酶，其中只有聚合酶III是DNA复制必需，作用是随复制叉移动延长新生链； 聚合酶I主要是添补后滞链的间隙及负责损伤DNA的修复等功能； DNA聚合酶I具有5’→3’方向核酸外切酶活性，能切除引物RNA。 4、DNA聚合酶的种类——真核生物
真核生物中发现5种DNA
DNA合成期水平升高，主要负责复制引发和后滞链部分序列的合成； DNADNA
5、DNA聚合酶的功能 1）DNA合成所必需
DNA合成活性是所有DNA聚合酶的基本功能，在其催化下作为合成前体的dNTP可依照模板连接到新生链的3‘-OH端。
/
switch）；
3’→5
DNA合成的两种基本类型：DNA复制和修复 2）多方面的核酸酶活性
缺口翻译（nick translation）
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可利用双螺旋DNA链上由一个磷酸二酯键断裂产生的缺刻(nick)，将一条单链降解并从缺刻的3’-OH端合成一条新链替代降解的同源链，这一过程称缺口平移。 3）保证DNA复制的准确性
校正(proofreading) 纠正蛋白质或核酸合成发生错误的机制，包括对已加入到合成链上的单位进行核查，对错配碱基依靠聚合酶3’→5’核酸外切活性来校正。 DNA聚合酶在两个阶段控制碱基配对的特异性：
合成前错误控制：通过对不同碱基特性的特异性识别、核对所引入的碱基是否与模板碱基配对； 合成后校正：检查生长链末端碱基配对情况，通过外切功能除去错配碱基。 6、DNA聚合酶的结构
DNA结合于三个结构域所组成的大沟上。
“手掌”结构域：具有高度保守的模体，提供催化活性位点。 “手指”结构域：将模板正确结合到活性位点。 “拇指”结构域：行使前进能力。 N结构域：核酸酶活性。 7、DNA聚合酶III全酶装配模型 ? ? ? ?
;
专门催化“切刻”——即二酯键的5‘-磷酸基与3’-羟基的连接，要求各自的碱基处于配对状态。 连接所需的能量来自NAD+（细菌）或ATP（真核细胞、古细菌）。
DNA;
DNA滑动的“滑动夹”，使核心酶附着于模板;
.
（二）DNA连接酶
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? 连接酶在DNA复制、重组、修复中均有重要作用。 在DNA合成过程中合成RNA引物。 功能：
1）在起点处起始先导链的合成(1次)； 2）协助冈崎片段的反复起始。
引发体(primesome)：由引发酶和解旋酶形成的功能复合物。引发酶的有效引发活性依赖于解旋酶。 不同的复制子对引发要求不同，有的复制起点可被引发酶直接识别，没有引发体，如噬菌体G4； 制子的引发体含有多个蛋白，结构复杂。
（三）DNA引发酶
复制体成分 DNA聚合酶 DNA连接酶 单链结合蛋白 DNA解旋酶 DNA拓扑异构酶 引发酶 RNaseH 在复制中的功能 多种形式，分别负责先导链的合成，后滞链的合成及后滞链的修复 连接修复的后滞链片段 稳定复制叉的单链区域 使复制叉前面的DNA解链 释放因解旋酶的活性而造成的扭曲链，复制后使松弛的DNA双链恢复负超螺旋； RNA 切除RNA引物
第三节 原核生物的复制机理
一、DNA复制的起始与引发 （一）引发的一般原则与策略